Notas de Aplicaciones
13ene/15

Determinacion de las constantes cineticas de la fosfatasa acida de germen de trigo y efecto del pH sobre su actividad.

Determinación de las constantes cinéticas de la fosfatasa ácida de germen de trigo y efecto del pH sobre su actividad.

Estudio realizado por el Institut Químic de Sarrià.

1. OBJETIVOS

  • Determinación de la actividad enzimática de la fosfatasa ácida de germen de trigo mediante un método colorimétrico discontinuo.
  • Estudio del efecto del pH sobre su actividad.
  • Determinación de la constante de Michaelis (KM) para el p-nitrofenil-fosfato (pNPP), la velocidad máxima (Vmax), y la constante de inhibición (Ki) por fosfato de la fosfatasa.

2. INTRODUCCIÓN

La cinética enzimática estudia la velocidad de las reacciones químicas que son catalizadas por las enzimas (E). Para muchos enzimas que catalizan reacciones con un único sustrato (S), la velocidad de catálisis (V) (moles de producto (P) formado por segundo) varía de forma no lineal con la concentración de sustrato [S], siguiendo una cinética de saturación por sustrato de tipo Michaelis-Menten. La ecuación de Michaelis-Menten (V = Vmax S / (KM + S)) define el comportamiento cinético de estas enzimas. La constante de Michaelis KM se define como la concentración de sustrato [S] a la que la velocidad de la reacción enzimática es la mitad de la Vmax (cuando [S] = KM, entonces V = Vmax / 2). Cuando la [S] es mucho menor que la KM ([S]<<KM), la velocidad de la reacción incrementa de forma lineal con la [S]. Cuando la [S] es mucho mayor que la KM ([S]>>KM), entonces la velocidad es independiente de la [S] y V = Vmax. El valor de KM no sólo es variable en función de la naturaleza de la enzima y del sustrato, sino que también depende de las condiciones de temperatura y pH de la reacción.

Una forma tradicional de calcular los valores de KM y Vmax a partir de datos experimentales consiste en representar gráficamente los inversos de las concentraciones mM de sustrato (eje de abscisas) vs los inversos de la velocidad (eje de ordenadas) (representación de dobles inversos o Lineweaver-Burk). Esta representación de los puntos sigue una recta definida por la ecuación de Lineweaver-Burk (que se deriva de la ecuación de Michaelis-Menten) del tipo “y = mx + c”. A partir de los puntos de intersección de la recta de Lineweaver-Burk con el eje de la X y con el eje de la Y, se puede calcular los valores de KM y Vmax, respectivamente.

La inhibición enzimática se define como la disminución de la velocidad de la reacción catalizada por una enzima debido a la presencia de un inhibidor (I). Los inhibidores pueden actuar alterando los parámetros cinéticos (KM y Vmax), de forma que los valores observados en presencia del inhibidor se denominan KM aparente (KM-ap) y Vmax aparente (Vmax-ap). Las enzimas pueden inhibirse reversiblemente de forma competitiva y no competitiva. Los inhibidores competitivos se unen a la enzima impidiendo la unión del sustrato. Esto conlleva un incremento en la KM en presencia del inhibidor (KM-ap > KM), mientras que la Vmax se mantiene constante. Los inhibidores no competitivos se unen a un sitio regulador distinto al centro activo, y actúan disminuyendo la velocidad máxima (Vmax) de la reacción catalizada por la enzima (Vmax-ap < Vmax) sin alterar la KM (puesto que no alteran la unión de la enzima al sustrato). Consecuentemente, en la inhibición competitiva se observa una disminución del porcentaje de inhibición al incrementar la concentración de sustrato en la reacción, mientras que en la no competitiva el porcentaje de inhibición permanece constante. La constante de inhibición (Ki) mide la afinidad de la enzima por el inhibidor. En el caso de la inhibición competitiva, la Ki se puede deducir a partir de la KM y la KM-ap: KM-ap = KM {1 + ([I] / Ki )}

Las fosfatasas son una familia de enzimas que catalizan la hidrólisis de un grupo fosfato (desfosforilación). Su actividad es sensible al pH del medio, de forma que las fosfatasas alcalinas funcionan de forma óptima en condiciones de pH alcalino, mientras que las fosfatasas ácidas lo hacen en ambientes ácidos. La actividad fosfatasa se puede medir mediante un ensayo enzimático colorimétrico basado en su capacidad de hidrólisis del p-nitrofenilfosfato (pNPP) a p-nitrofenol: p-nitrofenilfosfato (pNPP) + H2O → p-nitrofenol + fosfato.

A diferencia del pNPP, el  producto de la reacción p-nitrofenol es un compuesto amarillo que presenta un máximo de absorbancia a 405 nm en un medio alcalino que se puede monitorizar mediante espectrofotometría.

En este ensayo se determinará la actividad fosfatasa ácida de un preparado de germen de trigo, y se ensayará cómo esta actividad se ve afectada por cambios en el pH y en la [S], y por la presencia de un inhibidor. Por un lado, se ensayará la actividad fosfatasa en distintas condiciones de pH y se determinará el pH óptimo. Por otro, se determinará la actividad fosfatasa a pH óptimo en presencia de distintas concentraciones de pNPP y de fosfato inorgánico, un inhibidor reversible de la fosfatasa, y se determinará las constantes cinéticas KM, Vmax, KM-ap, Vmax-ap y Ki.

3. CONCEPTOS BÁSICOS

  • Ensayo enzimático colorimétrico discontinuo
    • ε = Coeficiente de extinción molar
    • Abs = Absorbancia
    • c = Concentración
    • l = Longitud del paso de luz (path length) (cm)
  • Unidades de actividad enzimática (U, µmol/min), actividad específica (U/mg) y concentración enzimática (U/ml)
  • Representación y ecuación de Michaelis-Menten y de Lineweaver-Burk
  • Velocidad de catálisis (V), velocidad máxima (Vmax) y constante de Michaelis-Menten (KM)
  • Inhibición reversible competitiva y no competitiva
  • KM aparente (KM-ap), Vmax aparente (Vmax-ap) y constante de inhibición (Ki)
  • Ecuación de Lambert-Beer:   Abs = ε · c · l

4. MATERIAL Y REACTIVOS

  • Selecta Spectrophotometer UV-3100. Código 4120021
  • Selecta PH Meter PH-2006. Código 4120600
  • Selecta Microcentrífuga Sigma 1-14. Código 5710014
  • Selecta Vórtex Heidolph Reax Top. Código 5411000
  • Selecta Baño termostático Precisterm. Código 6000387
  • Selecta Agitador magnético  Agimatic-E. Código 7002431
  • Balanza analítica. Código 5830039  
  • Micropipetas.
  • Germen de trigo
  • Ácido cítrico monohidrato
  • p-nitrofenil-fosfato (pNPP)
  • Citrato de trisodio dihidratado
  • Tris-base
  • Ácido clorhídrico
  • Carbonato de sodio
  • Fosfato monopotásico

5. PROCEDIMIENTO

1. PREPARACIÓN DE TAMPONES Y DISOLUCIONES.

Con la ayuda del Selecta PH Meter PH-2006 y del Selecta Agitador magnético con placa calefactora Agimatic-E, preparar las siguientes disoluciones.

1.1.  Preparación de tampones citrato 0,2 M a pH 3, 4, 5 y 6.

1.1.1.     Preparar tampón citrato 0,2 M a pH 3, 4, 5 y 6 mezclando las siguientes soluciones stock en las proporciones adecuadas:

  • Solución A: Ácido cítrico monohidrato 0,2 M en agua desionizada.
  • Solución B: Citrato de trisodio dihidratado 0,2 M en agua desionizada.

1.2.  Preparación de tampones tris 0,2 M a pH 7, 8, y 9. 1.2.1. Preparar tampón tris 0,2 M a pH 7, 8 y 9 utilizando tris-base y ajustando el pH con ácido clorhídrico 6 N.

1.3.  Preparación de carbonato de sodio 0,1 M en agua desionizada.

1.4.  Preparación de fosfato monopotásico 50 mM en agua desionizada.

2. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD FOSFATASA DE GERMEN DE TRIGO. Se ensayará la actividad fosfatasa ácida de un producto parcialmente purificado de germen de trigo. Para ajustar las condiciones del ensayo, se testarán distintas diluciones de la muestra y distintos tiempos de reacción. NOTA: Para preservar la actividad fosfatasa, mantener la muestra stock y las respectivas diluciones en hielo.

2.1.  A partir del preparado de germen de trigo, preparar el siguiente banco de diluciones en agua:

  • 0,5 ml a 1 mg/ml
  • 0,5 ml a 0,5 mg/ml
  • 0,5 ml a 0,25 mg/ml
  • 0,5 ml a 0,125 mg/ml
  • 0,5 ml a 0,05 mg/ml

2.2.  Con la ayuda del Selecta Vórtex Heidolph Reax Top, en un tubo Eppendorf, preparar 1 ml de 50 mM p-nitrofenil-fosfato (pNPP) en agua desionizada. NOTA: El pNPP es muy lábil, y se debe preparar fresco y mantener protegido de la luz.

2.3.  Numerar 16 tubos Eppendorf y añadir los siguientes reactivos:

Tubo Agua Tampón citrato 0,2M pH 5 Germen de trigo
Blanco 200 µl - -
1.1 25 µl 125 µl 50 µl 1 mg/ml
2.1 25 µl 125 µl 50 µl 0,5 mg/ml
3.1 25 µl 125 µl 50 µl 0,25 mg/ml
4.1 25 µl 125 µl 50 µl 0,125 mg/ml
5.1 25 µl 125 µl 50 µl 0,05 mg/ml
1.2 25 µl 125 µl 50 µl 1 mg/ml
2.2 25 µl 125 µl 50 µl 0,5 mg/ml
3.2 25 µl 125 µl 50 µl 0,25 mg/ml
4.2 25 µl 125 µl 50 µl 0,125 mg/ml
5.2 25 µl 125 µl 50 µl 0,05 mg/ml
1.3 25 µl 125 µl 50 µl 1 mg/ml
2.3 25 µl 125 µl 50 µl 0,5 mg/ml
3.3 25 µl 125 µl 50 µl 0,25 mg/ml
4.3 25 µl 125 µl 50 µl 0,125 mg/ml
5.3 25 µl 125 µl 50 µl 0,05 mg/ml

NOTA: Se testará la actividad fosfatasa en cada una de las 5 diluciones de la muestra y en tres tiempos de reacción (10, 15 y 20 min).

2.4.  Mezclar los tubos suavemente, y con la ayuda de la Selecta Microcentrífuga Sigma 1-14, centrifugar brevemente.

2.5.  Preincubar los tubos a 37ºC en el Selecta Baño termostático Precisterm.

2.6.  Iniciar la reacción añadiendo 50 µl de pNPP 50 mM a cada tubo, siguiendo el mismo orden que se indica en la tabla, y con un intervalo de 30 s entre tubo y tubo. Mezclar brevemente con el Selecta Vórtex Heidolph Reax Top tras iniciar la reacción en cada tubo, e incubar a 37 ºC en el Selecta Baño termostático Precisterm.

2.7.  Dejar transcurrir la reacción durante 10 min exactos para los tubos 1.1-5.1, 15 min exactos para los tubos 1.2-5.2, y 20 min exactos para los tubos 1.3-5.3.

2.8.  Añadir 750 µl carbonato de sodio (Na2CO3) 0,1 M a cada tubo para detener la reacción a los tiempos indicados, también a intervalos de 30 s entre tubo y tubo y siguiendo el mismo orden. Mezclar por inversión.

2.9.  Transferir el volumen a una cubeta de espectrofotómetro y medir la absorbancia a 405 nm (A405) de cada una de las reacciones respecto la del blanco en el Selecta Spectrophotometer UV-3100.

2.10.  Para cada dilución de la muestra, representar gráficamente la A405 (eje Y) en función del tiempo de reacción (eje X).

2.11.  Calcular los µmoles totales de p-nitrofenol liberados a tiempo 15 min para cada una de las diluciones de muestra ensayada, utilizando la ecuación de Lambert-Beer y considerando que el coeficiente de extinción molar del p-nitrofenol es de ε =18.000 M−1 cm−1.

2.12.  Calcular las unidades de actividad fosfatasa (U, µmol/min) en cada una de las diluciones de muestra ensayada (a tiempo 15 min). Representar gráficamente la actividad fosfatasa (eje Y) en función de la concentración de las muestras ensayadas (eje X).

2.13.  Para aquellas diluciones de muestra que respondan dentro del rango lineal (a tiempo 15 min), calcular la concentración de actividad fosfatasa (U/ml), y la actividad fosfatasa por mg de preparado de germen de trigo (U/mg).

3. EFECTO DEL PH SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA FOSFATASA. Se ensayará la actividad fosfatasa a distintos pH entre 3 y 9. Para ello, se utilizará los tampones citrato 0,2 M a pH 3, 4, 5 y 6, y los tampones tris 0,2 M a pH 7, 8 y 9.

3.1.  En función de los resultados obtenidos en el punto 2, preparar una dilución de germen de trigo adecuada para el ensayo, y mantener en hielo.

3.2.  Con la ayuda del Selecta Vórtex Heidolph Reax Top, en un tubo Eppendorf preparar 1 ml de 50 mM p-nitrofenil-fosfato (pNPP) en agua desionizada.

3.3.  Numerar 8 tubos Eppendorf y añadir los siguientes reactivos:

Tubo Agua Tampón 0,2M Dilución de germen de trigo
Blanco 200 µl - -
1 25 µl 125 µl  pH = 3 50 µl
2 25 µl 125 µl  pH = 4 50 µl
3 25 µl 125 µl  pH = 5 50 µl
4 25 µl 125 µl  pH = 6 50 µl
5 25 µl 125 µl  pH = 7 50 µl
6 25 µl 125 µl  pH = 8 50 µl
7 25 µl 125 µl  pH = 9 50 µl

3.4  Mezclar los tubos suavemente, y con la ayuda de la Selecta Microcentrífuga Sigma 1-14, centrifugar brevemente.

3.5.  Preincubar los tubos a 37ºC en el Selecta Baño termostático Precisterm.

3.6.  Iniciar la reacción añadiendo 50 µl de pNPP 50 mM a cada tubo, siguiendo el mismo orden que se indica en la tabla, y con un intervalo de 30 s entre tubo y tubo. Mezclar brevemente con el Selecta Vórtex Heidolph Reax Top tras iniciar la reacción en cada tubo, e incubar a 37 ºC en el Selecta Baño termostático Precisterm.

3.7.  Dejar transcurrir la reacción a 37 ºC durante 15 min exactos.

3.8.  Añadir 750 µl carbonato de sodio (Na2CO3) 0,1 M a cada tubo para detener la reacción, también a intervalos de 30 s y siguiendo el mismo orden. Mezclar por inversión.

3.9.  Transferir el volumen a una cubeta de espectrofotómetro y medir la absorbancia a 405 nm (A405) de cada una de las reacciones respecto la del blanco en el Selecta Spectrophotometer UV-3100.

3.10.  Determinar los μmoles de p-nitrofenol producidos en cada reacción a partir de la ecuación de Lambert-Beer y el coeficiente de extinción molar del p-nitrofenol.

3.11.  Calcular las unidades de actividad enzimática (U, μmol/min) fosfatasa en cada una de las condiciones de pH ensayado.

3.12.  Representar gráficamente los resultados situando la actividad enzimática en el eje Y y el pH en el eje X.

4. DETERMINACIÓN DE LAS CONSTANTES CINÉTICAS DE LA FOSFATASA: KM PARA EL P-NITROFENIL-FOSFATO Y Ki PARA LA INHIBICIÓN POR FOSFATO. Para calcular la constante de Michaelis (KM) de la fosfatasa para el p-nitrofenil-fosfato, se determina la actividad de la enzima en distintas concentraciones de sustrato. La constante de inhibición (Ki) por fosfato se determina de la misma manera pero en presencia de una concentración constante del inhibidor fosfato.

4.1.  En función de los resultados obtenidos en el punto 2, preparar una dilución de germen de trigo adecuada para el ensayo, y mantener en hielo.

4.2.  Con la ayuda del Selecta Vórtex Heidolph Reax Top, preparar 1 ml de p-nitrofenil-fosfato (pNPP) 80 mM y 500 µl de pNPP 8 mM en tampón citrato 0,2 M pH 5.

4.3.  Numerar 17 tubos Eppendorf y añadir los siguientes reactivos:

Tubo Tampón citrato 0,2M pH=5 pNPP Agua KH2PO4 50 mM
Blanco 112,5 µl 12,5 μl de 80 mM 125 µl -
1 112,5 µl 12,5 μl   de 8 mM 75 µl -
2 100 µl 25 μl   de 8 mM 75 µl -
3 75 µl 50 μl   de 8 mM 75 µl -
4 50 µl 75 μl   de 8 mM 75 µl -
5 112,5 µl 12,5 μl de 80 mM 75 µl -
6 100 µl 25 μl de 80 mM 75 µl -
7 75 µl 50 μl de 80 mM 75 µl -
8 50 µl 75 μl de 80 mM 75 µl -
9 112,5 µl 12,5 μl   de 8 mM 25 µl 50 µl
10 100 µl 25 μl   de 8 mM 25 µl 50 µl
11 75 µl 50 μl   de 8 mM 25 µl 50 µl
12 50 µl 75 μl   de 8 mM 25 µl 50 µl
13 112,5 µl 12,5 μl de 80 mM 25 µl 50 µl
14 100 µl 25 μl de 80 mM 25 µl 50 µl
15 75 µl 50 μl de 80 mM 25 µl 50 µl
16 50 µl 75 μl de 80 mM 25 µl 50 µl

4.4.  Mezclar los tubos suavemente, y con la ayuda de la Selecta Microcentrífuga Sigma 1-14, centrifugar brevemente.

4.5.  Preincubar los tubos a 37ºC en el Selecta Baño termostático Precisterm.

4.6.  Iniciar la reacción añadiendo 50 µl de la dilución de germen de trigo a cada tubo excepto el blanco, siguiendo el mismo orden que se indica en la tabla, y con un intervalo de 30 s entre tubo y tubo. Mezclar brevemente con el Selecta Vórtex Heidolph Reax Top tras iniciar la reacción en cada tubo, e incubar a 37 ºC en el Selecta Baño termostático Precisterm.

4.7.  Dejar transcurrir la reacción a 37ºC durante 15 min exactos.

4.8.  Añadir 750 µl carbonato de sodio (Na2CO3) 0,1 M a cada tubo para detener la reacción, también a intervalos de 30 s y siguiendo el mismo orden. Mezclar por inversión.

4.9.  Anotar los valores de A405 y para cada reacción, calcular los siguientes parámetros:

  • Concentración inicial de sustrato [S] pNPP en mM.
  • Concentración de inhibidor [I] fosfato en mM.
  • Los μmoles de p-nitrofenol producidos en cada reacción a partir de la ecuación de Lambert-Beer y el coeficiente de extinción molar del p-nitrofenol.
  • La velocidad (V) de reacción: μmoles de p-nitrofenol liberados por minuto (μmol/min).
  • El % inhibición producida por el fosfato para cada concentración de sustrato.
    • % Actividad = (V con inhibidor / V sin inhibidor) x 100
    • % Inhibición = 100 - % Actividad
  • La inversa de la concentración inicial de sustrato (1/[S]) y de la velocidad de reacción (1/V).

4.10.  Representar gráficamente la curva de Michaelis-Menten de concentración de sustrato (eje de la X) vs velocidad (eje de la Y), con y sin inhibidor.

4.11.  Representar gráficamente los inversos de las concentraciones mM de sustrato (eje de la X) vs los inversos de la velocidad (eje la Y), con y sin inhibidor (representación de dobles inversos o Lineweaver-Burk).

4.12.  A partir de los puntos de intersección de la recta de Lineweaver-Burk con el eje de la X y con el eje de la Y, calcular los valores de KM (mM) y la Vmax (µmol/min), respectivamente, en ausencia del inhibidor. Estos valores se pueden deducir por extrapolación a partir de la regresión lineal:

4.12.1.     Cuando y = 0, KM = -1/x. 4.12.2.     Cuando x = 0, Vmax = 1/y.

4.13.     De forma equivalente, a partir de la representación de Lineweaver-Burk calcular los valores de KM aparente (KM-ap) y de Vmax aparente (Vmax-ap) de la enzima en presencia del inhibidor fosfato.

4.14.     En base a los datos de % de inhibición por fosfato y de las variaciones entre KM y KM-ap, y Vmax y Vmax-ap, determinar si la inhibición de la fosfatasa por fosfato es competitiva o no competitiva.

4.15.     En el caso de que la inhibición sea de tipo competitiva, calcular el valor de la constante de inhibición (Ki) (mM) de la fosfatasa por fosfato a partir de la KM, KM-ap, y [I].

6. BIBLIOGRAFÍA

  • BIOQUÍMICA 7ED. L. Stryer / J. Berg / J. Tymoczko.
  • Brouillard, J., and Quellet, L. (1965). Acid phosphatases of wheat germ. Chromatographic analysis. Can. J. Biochem., 43, 1899-1905.
  • Waymack, P.P., and van Etten, R.L. (1991). Isolation and characterization of a homogeneous isoenzyme of wheat germ acid phosphatase. Arch. Biochem.Biophys., 288, 621-33.