Notas de Aplicaciones
21jun/11

DETERMINACION DE PROTEINAS POR EL METODO DE KJELDAHL / KJELDAHL METHOD FOR PROTEIN DETERMINATION

Francisco Santiago. Engineering Department.

INTRODUCCIÓN

El contenido total de proteínas en los alimentos está conformado por una mezcla compleja de proteínas. Estas existen en una combinación con carbohidratos o lípidos, que puede ser física o química. Actualmente todos los métodos para determinar el contenido protéico total de los alimentos son de naturaleza empírica. Un método absoluto es el aislamiento y pesado directo de la proteína pero dicho método se utiliza  sólo a veces en investigaciones bioquímicas debido a que es dificultoso y poco práctico

En 1883 el investigador danés Johann Kjeldahl desarrolló el método más usado en la actualidad para el análisis de proteínas (método Kjeldahl) mediante la determinación del nitrógeno orgánico. En esta técnica se digieren las proteínas y otros componentes orgánicos de los alimentos en una mezcla con ácido sulfúrico en presencia de catalizadores.  El nitrógeno orgánico total se convierte mediante esta digestión en sulfato de amonio.  La mezcla digerida se neutraliza con una base y se destila posteriormente. El destilado se recoge en una solución de ácido bórico.  Los aniones del borato así formado se titulan con HCl (o H2SO4) estandarizado para determinar  el nitrógeno contenido en la muestra.

El resultado del análisis es una buena aproximación del contenido de proteína cruda del alimento ya que el nitrógeno también proviene de componentes no proteicos.

El método Kjeldahl ha sufrido varias modificaciones. Originalmente se utilizó permanganato de potasio para llevar a cabo el proceso de oxidación (digestión), sin embargo, los resultados no fueron satisfactorios, de manera que este reactivo se descartó.  En 1885 Wilforth encontró que se podía acelerar la digestión utilizando ácido sulfúrico y añadiendo un catalizador.  Gunning en 1889 propuso añadir  sulfato de potasio que eleva el punto de ebullición del ácido sulfúrico utilizado en la digestión para disminuir el tiempo de la reacción.

En  la actualidad se utiliza principalmente Sulfato de Cobre penta hidratrado CuSO4.5H2O como catalizador.

REACCIONES LLEVADAS A CABO EN EL MÉTODO DE KJELDAHL

DIGESTIÓN

catalizadores→
(1) n - C -NH2 + mH2SO4 CO2 + (NH4)2 SO4 + SO2
proteína                                calor→

NEUTRALIZACIÓN Y DESTILACIÓN

(2) (NH2)SO4 + 2 NaOH          →          2NH3 + Na2SO4+ 2H2O
(3) NH3 + H3BO3 (ácido bórico)         →          NH4 + H2BO3- (ión borato)

TITULACIÓN

El anión borato (proporcional a la cantidad de nitrógeno) es titulado con HCl (o H2SO4) estandarizado:

(4) H2BO3- + H+             → H3BO3

MATERIAL
J.P SELECTA suministra los equipos necesarios para la realización del procedimiento por el método Kjeldahl.

-1 bureta electrónica “Digitrate-Pro 50”  resolución 0.01 ml.
Código 0182026

-1 balanza analítica de precisión “FA-2204B” resolución 0,1mg.
Código
5830039

-1 Unidad de digestión (Bloc Digest) para 6, 12 y 20 plazas.
Códigos
4000629, 4000630, 4000631

-1 Unidad Scrubber.
Código
4001611

-1 Bomba de circulación de agua.
Código 4001612

-1 Aparato destilador Kjeldahl (Pro Nitro M, S o A).
Códigos 4002627, 4002851, 4002430

- Material diverso de laboratorio

REACTIVOS

Reactivos preparados:

Es aconsejable la utilización de reactivos ya preparados, especialmente el HCl (o H2SO4) de valoración. Cualquier error en su preparación puede afectar directamente al resultado de la determinación.

Utilizar los siguientes, o sus equivalentes en otras marcas:

•      Ácido Bórico (en polvo) 99.5%     PANREAC 141015
•      Indicador  mixto 4.8 (ó 5) RV   PANREAC 283303

(Rojo metilo + Verde de Bromocresol)

•      Indicador mixto  4.4 RV   PANREAC 282430

(Rojo metilo + Azul de Metileno)

•      HCl 0.1N SV   PANREAC 171023
•      HCl 0.25N SV   PANREAC 182318
•      H2SO4 0.1N SV   PANREAC 181061
•      H2SO4 0.2N SV   PANREAC 182011
•      Sodio Hidróxido 40% RE   PANREAC 171220

(Para determinación de N)

•      Acetanilida 99% (Patrón para validación)   PANREAC 151005
•      Amonio sulfato (Patrón para validación)   PANREAC 131140
•      Catalizador Kjeldahl 6.25% Cu tabl. 8g   PANREAC 174428

Preparación de la solución fijadora de amoníaco

1.- Con indicador Mixto 4.8 (ó 5)

Preparar la solución de la siguiente fórmula para 1 litro de solución fijadora:

•      Pesar 10g de Acido Bórico (en polvo)   PANREAC 141015
•      Disolverlo en 1 litro de agua destilada.
•      Añadir 15ml de Indicador mixto 5.   PANREAC 283303

2.- Con indicador mixto 4.4

Preparar la solución de la siguiente fórmula para 1 litro de solución fijadora:

•      Pesar 10g de Ácido Bórico (en polvo)   PANREAC 141015
•      Disolverlo en 1 litro de agua destilada.
•      Añadir 10ml de Indicador mixto 4.4.   PANREAC 282430

PROCEDIMIENTO

REPARACIÓN DE LA MUESTRA
  1. Triturar, homogeneizar y mezclar la muestra.
  2. Pesar entre 1 y 2 gramos de muestra.
  3. En muestras con contenidos de nitrógeno muy pequeño, tomar la muestra suficiente para que contenga como mínimo 5 mg de nitrógeno.
DIGESTIÓN

•   Añadir entre 10 y 15 ml (tubo macro) de H2SO4 96-98% y 1 tableta (8 gm) de catalizador.
(Para el tubo micro, el máximo de H2SO4  es 5ml)
•   Montar un sistema para la extracción de humos o scrubber con Na2CO3.
•   Realizar la digestión en tres pasos:

1. En función del contenido de agua de la muestra, empezar la digestión evaporando agua a 150ºC entre 15 y 30 minutos.
2.
Realizar un segundo paso entre 270 y 300ºC entre 15 o 30 minutos para reducir la producción de humos blancos.
3.
Continuar la digestión a 400ºC entre  60  y 90 minutos.

Algunos ejemplos:

Queso o carne:
Paso1º: 150ºC / 30’            Paso 2 : 270ºC / 30’            Paso 3: 400ºC / 90’

Cereales:
Paso1º: 150ºC / 15’            Paso 2 : 300ºC / 15’            Paso 3: 400ºC / 60’

Control Visual: El resultado es un líquido transparente nítido con coloración azul claro, verde o amarillo dependiendo del catalizador utilizado. No deben quedar restos negros adheridos a la pared de tubo.

Nota: Durante la digestión debe controlarse la producción de espuma en las muestras. Si esta es excesiva, debe alargarse el paso nº 1.

DILUCIÓN

•   Sacar los tubos muestra del bloque digestor y dejar enfriar a Tª ambiente. (Puede forzarse     sumergiendo los tubos, cautelosamente, en un poco de agua).
•   Añadir unos 25ml de agua destilada en cada tubo.
•   Añadir el agua despacio y moviendo el tubo sin dejar solidificar la muestra. Si es necesario     calentar ligeramente el tubo (por ej. introduciéndolo en el bloque digestor todavía caliente)
•   Dejar enfriar de nuevo hasta Tª ambiente.
•   Para evitar pérdidas de nitrógeno y reacciones violentas no introducir el tubo todavía caliente     al destilador.

DESTILACIÓN

•   Situar un Erlenmeyer de 250ml a la salida del refrigerante con 50ml de ácido Bórico y unas     gotas de indicador.
•   Programar una dosificación de 50 a 75 ml de NaOH.
•   Introducir el tubo con la muestra en el destilador.
•   Destilar hasta recoger 250ml en el Erlenmeyer (50ml Bórico + 200ml de destilado).

Control Visual: Una vez se ha añadido el NaOH, la muestra debe tomar una coloración azulada, de no ser así, añadir más NaOH.

VALORACIÓN Y CÁLCULO

•   Valorar el destilado con HCl ó H2SO4  hasta el cambio de color. (punto final: pH 4.65)
Moles de HCl = Moles de NH3 = Moles de N en la muestra
Moles de H2SO4= 2Moles de NH3 = 2Moles de N en la muestra
•   Realizar el cálculo:

mg N = N x  V   x  14

Donde:

N = Normalidad del ácido de valoración
V = Volumen de ácido consumido
14 = Peso atómico del nitrógeno.

•   Para pasar a contenido de proteínas corregir por el factor adecuado según la naturaleza de la     muestra. (6.25 por defecto)
•   Periódicamente realizar un ensayo en blanco y restarlo del resultado.

% Proteínas =   P2/P0 x 100 x F

Donde:

P2: Nitrógeno (mg).
P0: Peso de la muestra (mg).
F: Factor proteínico.
(6.25 por defecto)

Factor protéico de algunos alimentos:

Almendras  5,18
Nueces 5,30
Nueces - cacahuetes  5,41
Gelatina 5,55
Soja 5,71
Cebada, avena, centeno 5.83
Trigo, harina entera 5,83
Harinas (no entera) 5,70
Arroz  5,95
Maíz  6,25
Todos los otros alimentos 6,25
Salvado 6,31
Leche y lácteos 6,38

VERIFICACIÓN DE LA RECUPERACIÓN CON AMONIO SULFATO

Esta verificación es ampliamente utilizada para certificar el funcionamiento del destilador.

Se trata de preparar una muestra cuyo contenido de nitrógeno es conocido. Esta se destila, se valora con HCl 0.25N y se calcula el Nitrógeno detectado.

El porcentaje de nitrógeno detectado sobre el de la muestra se denomina recuperación de Nitrógeno.

Preparar la muestra:

Contenido de nitrógeno de una muestra de Amonio sulfato :

Formula: (NH4)2 SO4
Peso molecular: 132.14ç
Factor: 14 * 2 / 132.14 = 0.212
mg de Nitrógeno = 0.212 * mg de Amonio sulfato

•   Pesar unos 100mg  de amonio sulfato. El peso exacto será P0
•   La cantidad exacta de Nitrógeno es:

P1  (mg) = P0   x 0,212

•   Destilar añadiendo 25ml de NaOH
•   Una vez destilado y valorado obtenemos el nitrógeno (mg) detectado: P2

P2 =  N  x  V   x  14

Donde:

N  = Normalidad del ácido de valoración (HCl  0.25)
V  = Volumen de ácido consumido
14 = Peso atómico del nitrógeno.

•   Calculamos la recuperación:

R(%) = P2 / P1 *100

•   La recuperación aceptable es entre 99.5 y 100.5 %.

Si se utiliza HCl de normalidad diferente preparar muestras:

NormalidadMuestra de Amonio sulfato.

0,05                               20 ...  40 mg

0,1                                 40 ...  90 mg

0,25                               100  …  200 mg

0,5                                 200  …  400  mg

VERIFICACIÓN DE LA RECUPERACION CON ACETANILIDA

Esta verificación es ampliamente utilizada para certificar el funcionamiento del proceso completo del análisis del nitrógeno Kjeldahl que incluye las etapas de digestión, destilación y valoración.

Se trata de preparar una muestra cuyo contenido de nitrógeno es conocido. Esta se digiere, se destila, se valora y se calcula el Nitrógeno detectado.

El porcentaje de nitrógeno detectado sobre el de la muestra se denomina recuperación de Nitrógeno.

Para realizar ésta verificación se utiliza la Acetanilida.

Preparar la muestra:

Contenido de nitrógeno de una muestra de Acetanilida :

Fórmula: C8H9NO
Peso molecular: 135.17
Factor: 14 / 135.17 = 0.1035
mg de Nitrógeno = 0.1035 * mg de Acetanilida

•   Pesar alrededor de 250mg  de acetanilida. El peso exacto será P0
•   La cantidad exacta de Nitrógeno es:

P1  (mg) = P0   x  0,1035

Digestión de la muestra:

•   Colocar la acetanilida en un tubo, añadir 10ml de ácido sulfúrico 98%  y una tableta de     catalizador Kjeldahl.
•   Digerir a 400ºC durante 1h. (El resultado debe ser un líquido transparente con coloración     azul.)
•   Dejar enfriar y añadir 25ml de agua destilada en cada tubo. Tomar precauciones para evitar     salpicaduras. La reacción del agua sobre el ácido sulfúrico es violenta.

Destilar:

•   Destilar añadiendo 75ml de NaOH. Utilizar HCI 0.25N  para la valoración.
•   Una vez destilado y valorado, obtenemos el nitrógeno (mg) detectado: P2

Donde:

N  = Normalidad del ácido de valoración (HCl  0.25).
V  = Volumen de ácido consumido.
14 = Peso atómico del nitrógeno.
P2 = N  x  V   x  14

•   Calculamos la recuperación:

R(%) = P2 / P1 *100

•   La recuperación aceptable es entre 99.5 y 100.5 %.

FUENTES DE ERROR

Las principales fuentes de error son:

En el proceso de digestión:

1.- La inclusión de nitrógeno no protéico (aunque la cantidad de este nitrógeno suele ser despreciable comparada con la del nitrógeno protéico);
2.- La pérdida de nitrógeno durante la digestión. El exceso de sulfato de sodio o potasio  que se añade al ácido para elevar el punto de ebullición, puede producir una descomposición por calor y por lo tanto pérdida de nitrógeno. Por otro lado, el exceso de catalizador (de cobre generalmente) también puede producir pérdidas de nitrógeno
3.- La digestión incompleta de la muestra. Generalmente debida a falta de tiempo de reacción o falta de ácido sulfúrico.

Durante la destilación:

1.- Neutralización incompleta de la mezcla digerida. Es necesario añadir suficiente NaOH para neutralizar el exceso de ácido sulfúrico resultante de la digestión así como transformar todo el amonio formado en la digestión en amoníaco.
2.- Perdida de amoníaco por fugas en el circuito de destilación.
3.- Perdida de amoniaco por refrigeración insuficiente en el condensador.

BIBLIOGRAFÍA

A.O.A.C. 1980. Association of Official Agricultural Chemists.  Official Methods of Analysis. Washington, D.C.
Nielsen, S.S. 1994. Introduction to the Chemical Analysis of Foods. Ed. Jones and Bartlett Publishers. U.S.A. pp 209-212.
Ranganna, S. 1977. Manual of Analysis of Fruit and Vegetable Products.  Ed. McGraw-Hill Publishing Co. Ltd. New Delhi.
Yeshajahu P. y Meloan C.E. 1987. Food Analysis. Theory and Practice. 2ª. Ed. AVI U.S.A. pp 753-758.

9dic/10

VALIDACION DEL PROCEDIMIENTO DE ANALISIS DE N-KJELDAHL EN AGUAS RESIDUALES / N-KJELDAHL ANALYSIS PROCEDURE VALIDATION IN WASTEWATER

M. Monras, licenciado en ciencias químicas (Institut Quimic de Sarrià).
Lourdes Margarit, ingeniera química. (IQS); Departamento de química analítica.
Mª José Blanco, Gestión de la calidad (IQS).
David Pecanins, Ingeniero del departamento de Calidad de J.P. SELECTA, s.a.

0. SUMARIO

En este trabajo se ha validado el procedimiento de análisis de N-Kjeldahl en aguas residuales en un rango de concentraciones comprendido entre 20 y 1000 mg N/L, incluyendo el cálculo de la incertidumbre asociada al análisis.

Todos los análisis se han llevado a cabo con la unidad de digestión “Bloc-digest” JP Selecta y con el “Destilador automático PRONITRO “A”” JP Selecta.

1. INTRODUCCIÓN.

La determinación del contenido en nitrógeno de una muestra es de gran interés en el ámbito alimentario y medioambiental. En 1883, el químico danés Johan Kjeldahl (1849-1900) presentó por primera vez en la “Danish Chemical Society” un método para la determinación de lo que se conoce como “nitrógeno Kjeldahl”, que proporciona el contenido de nitrógeno orgánico más nitrógeno amoniacal de una muestra. (1)

A partir de esta fecha, el método Kjeldahl ha sido objeto de estudio continuo en el campo de la química analítica y se ha optimizado en las tres etapas en que se fundamenta: (2)

1. Digestión de la muestra en medio ácido: en esta etapa tiene lugar la conversión de la mayoría del nitrógeno orgánico y amoniacal en ion amónio. La eficiencia del proceso de la digestión ha ido mejorando a lo largo de los años con la adición de sales inorgánicas para aumentar el punto de ebullición del ácido sulfúrico, la utilización de bloques digestores (introducida en 1970 por el químico sueco Roger Moosberg), la optimización del tiempo y temperatura de digestión y el uso de diferentes sustancias como catalizadores.

2. Basificación y destilación de la muestra: en esta etapa se libera amoníaco, el cual es retenido en una disolución con una cantidad conocida de ácido o en una disolución de ácido bórico. Inicialmente se realizaba una destilación simple con un baño de vapor, aunque actualmente ha sido ya sustituida por una destilación por arrastre de vapor de agua, la cual permite disminuir considerablemente el tiempo de análisis.

3. Valoración ácido-base: ésta puede ser una valoración por retroceso, si el amoníaco liberado ha sido recogido sobre una solución ácida, o una valoración directa, si el amoníaco liberado se ha recogido sobre una solución de ácido bórico. Inicialmente, el punto final de la valoración se detectaba mediante un cambio de color de un indicador; posteriormente, se introdujeron los valoradores automáticos con detección del punto final de la valoración por potenciometría.

Hoy en día, la instrumentación en los laboratorios de análisis químico tiende a la automatización. Así, existen en el mercado equipos que integran las diferentes etapas del método Kjeldahl haciéndolo mucho más rápido y fácil de utilizar, como el destilador automático PRONITRO “A” JP Selecta.

El método Kjeldahl es un método de referencia para la determinación de nitrógeno orgánico y amoniacal y está aceptado por importantes organismos internacionales como la AOAC International, EPA, AACC, AOCS, ISO o USDA. Actualmente, cualquier laboratorio que trabaja en un entorno de calidad debe demostrar la fiabilidad de los datos que genera. Así, se hace necesario que cada laboratorio valide los métodos de análisis que utiliza.

2. MATERIALES.

Reactivos y patrones:

  • Sulfato amónico patrón.
  • Acetanilida patrón.
  • Catalizador de mineralización ( se prepara mezclando íntimamente 0.1 g de sulfato de cobre por cada gramo de sulfato potásico).
  • Ácido sulfúrico concentrado.
  • Solución de hidróxido sódico 40 % (p/v).
  • Ácido clorhídrico (soluciones valoradas 0.100 N y 0.500 N).
  • “Disolución fijadora de amoníaco” preparada comercialmente ( composición: 1g de ácido bórico, 0.75 mg de rojo de metilo, 1 mg de verde de bromocresol, 1.5 mL de metanol, hasta 100 mL con agua)
  • Agua desionizada calidad milli-Q.


Muestras:

- Aguas residuales industriales.
- Aguas residuales procedentes de un ejercicio comparativo entre laboratorios.

3. EQUIPO.

- Unidad de digestión “Bloc Digest” JP Selecta.

Unidad de digestión "Bloc-Digest"

- Destilador automático PRONITRO “A” JP Selecta.

El destilador automático PRONITRO “A” JP Selecta es un equipo que realiza análisis de nitrógeno por el método Kjeldahl. Dicho equipo dosifica la cantidad deseada de reactivos para el análisis, hace una destilación por arrastre de vapor de la muestra proveniente de la etapa de digestión y una valoración ‘on line’ del destilado, detectando el punto final automáticamente por cambio de color.

El equipo permite dosificar hasta 30 mL de reactivo valorante y seleccionar su concentración entre un 0.01 y 0.50 N en intervalos de 0.01 N. Así, seleccionando oportunamente la concentración del ácido valorante, se puede determinar, con un nivel de exactitud y precisión adecuados, un rango de entre 0.5 hasta 200 mg de nitrógeno en muestra. (3)

4. MÉTODO EXPERIMENTAL

Todos los análisis del presente trabajo se han llevado a cabo según la siguiente metódica: (4)

  • Se introduce, en un tubo de muestra, el volumen de agua residual para el análisis, 1g de catalizador de mineralización y 6 mL de ácido sulfúrico concentrado.
  • Se coloca el tubo de muestra en el bloque digestor a una temperatura ligeramente superior a 100ºC durante suficiente tiempo para que se evapore el agua.
  • Se aumenta la temperatura del bloque digestor hasta aproximadamente 420 ºC y se mantiene el tiempo suficiente para que se produzca la digestión total de la muestra. Se considera que se ha acabado la digestión cuando la muestra queda de un color azul-verdoso claro transparente.
  • Se dejan enfriar las muestras a temperatura ambiente y se les añade aproximadamente 25 mL de agua milli-Q.
  • Se analiza el contenido del tubo de muestra procedente de la digestión con el destilador automático PRONITRO “A” JP Selecta, seleccionando la concentración del reactivo valorante en función de la cantidad de nitrógeno estimada en la muestra.

5. PROTOCOLO DE VALIDACIÓN. (5) (6)

La validación del método descrito anteriormente cubre el rango de 20 a 1000 mg N/L. Para ello, se trabaja en tres niveles de concentración: nivel bajo (alrededor de 20 mg N/L), nivel medio (alrededor de 500 mg N/L) y nivel alto (alrededor de 1000 mg N/L).

El nivel bajo de concentración (muestra ad1) se prepara diariamente a partir de acetanilida patrón y agua milli-Q. Mientras que el nivel medio (muestra ad2) y nivel alto (muestra ad3) de concentración se preparan adicionando patrón de acetanilida a la muestra de agua residual industrial.

5.1. LINEALIDAD.

El estudio de la linealidad se lleva a cabo con soluciones patrón de sulfato amónico.

Los resultados obtenidos se presentan en las tablas 1 y 2.

Valor nominal
Valores experimentales
N/ mg (1)
HCl/ mL(2)
N / mg(3)
Recup./%
CV/%
blanco 0.26 --------- --------- ---------
0.50 2.05 0.50 99.9 1.80
1.00 3.74 0.97 97.5 1.58
2.00 7.27 1.96 98.1 1.05
4.00 14.78 4.07 101.7 1.63
5.00 18.32 5.06 101.2 0.56
6.00 21.83 6.04 100.7 0.57
8.00 29.32 8.14 101.7 0.65

Tabla 1. Resultados obtenidos utilizando como reactivo valorante HCl 0.02 N

Valor nominal
Valores experimentales
N/ mg (1)
HCl/ mL(2)
N / mg(3)
Recup./%
CV/%
blanco 0.04 --------- --------- ---------
20 2.81 19.4 97.0 1.65
40 5.67 39.4 98.5 1.61
50 7.21 50.2 100.5 0.08
70 9.78 68.2 97.5 1.75
100 14.50 101.3 101.3 0.21
125 18.19 127.1 101.7 0.19
150 21.88 152.9 102.0 0.19
175 25.43 177.8 101.6 0.19
200 29.10 203.5 101.8 0.14

Tabla 2. Resultados obtenidos utilizando como reactivo valorante HCl 0.50 N

En cada fila de tabla se presentan los valores medios de tres determinaciones hechas consecutivamente y en las mismas condiciones.

(1) Cantidad de nitrógeno que se introduce mediante soluciones patrón de sulfato amónico.
(2) Cantidad consumida de reactivo valorante.
(3) Cantidad de nitrógeno obtenida experimentalmente en el análisis. Se calcula con la siguiente fórmula: mg N = (mL HCl consumidos – mL HCl blanco)*14.007*NHCl

5.2. PRECISIÓN INTERMEDIA Y RECUPERACIÓN.

El estudio de la precisión intermedia y de la recuperación se realiza analizando, en tres días diferentes, la siguiente secuencia de muestras: dos blancos (uno se analiza con HCl 0.02N, mientras que el otro con HCl 0.10N), una muestra de agua residual (ya que conocer su concentración permitirá posteriormente calcular la recuperación a cada nivel de concentración), una muestra de nivel de concentración bajo (muestra ad1), una muestra de nivel de concentración medio (muestra ad2) y una muestra de nivel de concentración alto (muestra ad3), obteniéndose los siguientes resultados:

(Pulsar en imagen para verla ampliada)

Tabla 3. Resultados obtenidos para la precisión intermedia y recuperación en tres días diferentes.

A continuación se presenta el análisis de los datos de recuperación obtenidos en función del nivel de concentración, del día del análisis y globalmente.

Nivel bajo (muestra ad1)
Nivel medio (muestra ad2)
Nivel alto (muestra ad3)
Valor
promedio
Media/%
97.5 99.0 98.3 98.2
S/%
3.6 1.2 0.8 2.0
CV/%
3.7 1.3 0.8 2.1

Tabla 4. Parámetros estadísticos en función del nivel de concentración estudiado.

5.3. LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN.

Para el estudio del límite de cuantificación se trabaja con patrones de sulfato amónico, reactivo valorante HCl 0.02 N y se hacen tres replicados. Los resultados obtenidos se presentan en la siguiente tabla:

Valor nominal
Valores experimentales
N/ mg
HCl/ mL
N / mg
Recup./%
CV/%
blanco 0.26 --------- --------- ---------
0.1 0.59 0.09 90.6 11.71
0.2 0.91 0.18 90.6 4.09
0.5 2.05 0.50 99.9 1.80

Tabla 5. Resumen de los datos obtenidos para la determinación del límite de cuantificación del equipo.

A partir de estos datos se concluye que el equipo cuantifica con una exactitud y precisión satisfactorias a partir de 0.5 mg de nitrógeno. Teniendo en cuenta que el volumen de muestra habitual es de 50 mL, el límite de cuantificación del equipo se establece en 10 mg N/L.

Trabajando con muestras, el nivel más bajo de concentración que se ha estudiado (muestra ad1) ha sido el de 20 mg/L, que utilizando un volumen de muestra de 50 mL, implica que el equipo cuantifica alrededor de 1 mg N.

5.4. INCERTIDUMBRE.

A partir de los resultados obtenidos en la validación, se calcula la incertidumbre (u) asociada al análisis, a cada nivel de concentración, mediante la siguiente fórmula: (4)

(Pulsar en imagen para verla ampliada)

Se calcula la incertidumbre expandida (U) asociada al análisis como U=k*u, que para un nivel de significación del 95%, se coge un factor de cobertura de k=1.96.

Así, el resultado de un análisis puede expresarse como x ± U*x / 100

En la siguiente tabla se presentan los valores del cálculo de la incertidumbre a cada nivel de concentración estudiado:

Nivel de concentración
u patrón /%
u exactitud /%
u precisión /%
u/%
U
(k=1.96)/%
Nivel bajo
0.29 2.48 3.67 4.44 8.7
Nivel medio
0.29 1.02 1.26 1.65 3.2
Nivel alto
0.29 1.74 0.80 1.93 3.8

Tabla 6.

6. ANÁLISIS DE UN AGUA RESIDUAL.

Se ha hecho el análisis de una muestra de agua residual procedente de un ejercicio comparativo entre laboratorios. Se han analizado dos blancos y cuatro repeticiones de la muestra en el mismo día y en las mismas condiciones operatorias según el procedimiento descrito en el apartado 3, utilizando un volumen de muestra de 50 mL y como reactivo. valorante HCl 0.05 N, con los resultados que se muestran a continuación:

Muestra
Volumen react. valorante/ mL

Concentración/ mgN.L-1
Blanco
0.10 --------
Blanco
0.08 --------
Replicado nº1
1.99 26.61
Replicado nº2
1.83 24.37
Replicado nº3
1.98 26.47
Replicado nº4
1.85 24.65

Tabla 7.Resultados del análisis de aguas procedentes de un ejercicio comparativo entre laboratorios.

A continuación se comparan los resultados obtenidos con los resultados proporcionados en el ejercicio comparativo entre laboratorios.

Resultados obtenidos
Resultado ejercicio entre laboratorios (*)
Recup/%
Media/ mgL-1
25.5 27.0 94.4
S/ mgL-1
1.18 3.27
CV/ %
4.62 12.1

Tabla 8.

(*) Circuit Calitax. Agencia Catalana de l’aigua. Octubre 2002

Según el cálculo de la incertidumbre hecho en el apartado anterior (nivel de concentración bajo), el resultado obtenido en este análisis se puede expresar como 25.5 ± 2.2 mg N.L-1

7. CONCLUSIONES.

1. El equipo proporciona resultados satisfactorios trabajando con patrones en el margen comprendido entre 0.5 y 200 mg de nitrógeno, con valores de recuperación entre 97 y 103 %.
2.
La exactitud del método de análisis aplicado a aguas residuales se considera satisfactoria, ya que se obtienen unas recuperaciones entre 95 y 102%.
3.
La precisión intermedia del método también se considera satisfactoria, ya que en todos los casos se obtienen valores de coeficiente de variación en las recuperaciones inferiores al 5%. Además, cabe destacar en los niveles de concentración medio y alto, estos valores de coeficientes de variación son inferiores al 2%.
4.
Se ha obtenido un resultado de 25.5 ± 2.2 mg N.L-1 en el análisis de aguas procedentes de un ejercicio comparativo entre laboratorios. Este margen incluye el valor considerado verdadero 27.0 mg N.L-1.
5.
El equipo “Destilador automático PRONITRO “A” JP Selecta ” es de fácil manejo y mantenimiento, y permite ahorrar tiempo en las determinaciones de nitrógeno por el método Kjeldahl.

8. BIBLIOGRAFIA.

(1) Thiex, N.J., Manson, H., Anderson, S., Persson, Determinacion of crude protein in Animal Feed, Forage, Grain, and Oilseeds by Using Block Digestion with a Copper Catalyst and Steam Distillation into Boric Acid: Collaborative Study, Journal of AOAC International, 85, 2, 309-317 (2002)
(2) Ogg, Clyde L., Treatise on analytical chemistry: edited by I.M.Kolthoff and Philip J.Elving with the assistance of B.Sandell, Vol x. Part 2. Kjeldahl Method, ………John Wiley and Sons, New York
(3) JP Selecta, Manual de instrucciones Destilador automático PRONITRO “A” JP Selecta (2006)
(4) Procedimiento interno IQS.
(5) Varios autores, 2001, Validación de métodos analíticos, AEFI, Barcelona.
(6) Miller, J.N., Miller, J.C., 2002, Estadística y quimiometría para química analítica, 4ª edición, Ed. Prentice Hall, Madrid.