Notas de Aplicaciones


M. Monras, Degree in Chemistry (Institut Quimic de Sarrià);
Lourdes Margarit, Chemical Engineer (IQS), Analytical Chemistry Department;
Mª José Blanco, Quality Management (IQS);
David Pecanins, Quality Department Engineer (J.P. SELECTA, s.a.)


In this research, the N-Kjeldahl analysis procedure has been validated in wastewater, in a concentration range between 20 and 1000 mg N/L, including the uncertainty calculation associated with the analysis.

All the analyses have been carried out with a JP Selecta “Bloc-digest” digestion unit and with a JP Selecta PRONITRO “A” automatic distillation unit.


In the food and environmental field, there’s a great interest in the determination of nitrogen content of a sample. In 1883, the Danish chemist Johan Kjeldahl (1849-1900) first introduced to the “Danish Chemical Society” a method for determination known as “Kjeldahl nitrogen”, which provides the organic nitrogen content plus ammoniacal nitrogen of a sample. (1)

From this date, the Kjeldahl method has been the subject of an ongoing study in the analytical chemistry field and has been optimized in the three stages in which it is based: (2)

1. Sample digestion in acid medium: most of the organic and ammoniacal nitrogen to ammonium ion conversion takes place in this stage. The digestion process efficiency has been improved over the years with the addition of inorganic salts, to increase the sulphuric acid boiling point, the use of digestion blocks (introduced in 1970 by the Swedish chemist Roger Moosberg), the digestion time and temperature optimization and the use of different substances as catalysts.

2. Basification and distillation of the sample: ammonia is released in this stage, which is held in a solution with a known acid amount or with a boric acid solution. Initially, a simple distillation with a stem bath was performed, but now it has been replaced by a steam water distillation, which allows a significant reduction of the analysis time.

3. Acid-base evaluation: this could be a backward evaluation, if the ammonia released has been collected on an acid solution, or a direct evaluation, if the ammonia released has been collected on a boric acid solution. Initially, the evaluation end point was detected by means of an indicator colour change; later on, the automatic values were introduced with the detection of the evaluation end point by potentiometry.

Today, instrumentation in chemical analysis laboratories tends to automation. Thus, there are some equipments in the market that cover several stages of the Kjeldahl method, making it faster and easier of use, such as JP Selecta PRONITRO “A” automatic distiller.

Kjeldahl method is a reference method for ammoniacal and organic nitrogen determination and it is accepted by major international organizations such as International AOAC, EPA, AACC, AOCS, ISO or USDA. Nowadays, any laboratory working in a quality environment must demonstrate reliability of the data generated. Thus, it is necessary that each laboratory validates the analytical methods used.


Reagents and Standards:

  • Ammonium sulphate standard.
  • Acetanilide standard.
  • Catalyst mineralization (it is prepared by intimately mixing 0.1g copper sulphate per gram of potassium sulphate).
  • Concentrated sulphuric acid.
  • Sodium hydroxide solution 40 % (p/v).
  • Hydrochloric acid (standard solutions 0.100 N and 0.500 N).
  • “Ammonium fixing solution” commercially prepared (composition: 1g of boric acid, 0.75mg of methyl red, 1mg of bromocresol green, 1.5mL of methanol, up to 100 mL with water).
  • Deionised water milli-Q quality.


- Industrial wastewaters.
- Sewage from a comparison between laboratories.


JP Selecta “Bloc Digest” digestion unit.

Unidad de digestión "Bloc-Digest"

- JP Selecta PRONITRO “A” automatic distiller.

JP Selecta PRONITRO “A” automatic distiller is an equipment which performs nitrogen analysis by Kjeldahl method. This equipment measures out the amount of reagent required for the analysis, makes a steam distillation of the sample from the digestion stage and an on-line evaluation of distillate, automatically detecting the end point by colour change.

The equipment allows a tritant reagent dosage up to 30mL and a concentration selection between 0.01 and 0.50N in increments of 0.01N. Thus, by appropriately selecting the tritant acid concentration, one can determine nitrogen in sample range between 0.5 and 200mg. (3)


All the analyses in this work have been carried out by using the following methods: (4)

  • Insert in a sample tube, the volume of wastewater for the analysis, 1g of mineralization catalyst and 6mL of concentrated sulphuric acid.
  • Place the sample tube in the digestor block at a temperature slightly above 100ºC during enough time for the water to evaporate.
  • Increase the digestor block temperature to approximately 420ºC and maintain it enough time to produce the sample total digestion. When the sample becomes a transparent clear green-blue colour, we consider the digestion has finished.
  • Samples are cooled down at room temperature and about 25mL of milli-Q water is added.
  • Analyze the sample tube content from the digestion with the JP Selecta PRONITRO “A” automatic distiller, selecting the tritant reagent concentration according to the estimated nitrogen amount in the sample.


The above described method validation covers the range from 20 to 1000mg N/L. In order to do this, we work in three concentration levels: low (around 20mg N/L), medium (around 500mg N/L) and high level (around 1000mg N/L).

The low concentration level (ad1 sample) is daily prepared from acetanilide standard and milli-Q water. Whereas in the medium (ad2 sample) and high levels (ad3 sample) the concentrations are prepared by adding acetanilide standard to the industrial wastewater sample.


The Linearity study is performed with standard solutions of ammonium sulphate.

The obtained results are presented in tables 1 and 2.

Nominal value
Experimental values
N/ mg (1)
HCl/ mL(2)
N / mg(3)
white 0.26 --------- --------- ---------
0.50 2.05 0.50 99.9 1.80
1.00 3.74 0.97 97.5 1.58
2.00 7.27 1.96 98.1 1.05
4.00 14.78 4.07 101.7 1.63
5.00 18.32 5.06 101.2 0.56
6.00 21.83 6.04 100.7 0.57
8.00 29.32 8.14 101.7 0.65

Table 1. Results obtained by using HCl 0.02 N as tritant reagent.

Nominal value
Experimental values
N/ mg (1)
HCl/ mL(2)
N / mg(3)
White 0.04 --------- --------- ---------
20 2.81 19.4 97.0 1.65
40 5.67 39.4 98.5 1.61
50 7.21 50.2 100.5 0.08
70 9.78 68.2 97.5 1.75
100 14.50 101.3 101.3 0.21
125 18.19 127.1 101.7 0.19
150 21.88 152.9 102.0 0.19
175 25.43 177.8 101.6 0.19
200 29.10 203.5 101.8 0.14

Table 2. Results obtained by using HCl 0.50 N as tritant reagent.

The average values of three consecutive determinations made under the same conditions are shown in each table row.

(1) Amount of nitrogen inserted by means of ammonium sulphate standard solutions.
(2) Amount of tritant reagent used.
(3) Amount of nitrogen derived from experiments in the analysis. This is calculated using the following formula: mg N = (mL HCl used – mL HCl white)*14.007*NHCl


The intermediate precision and recovery study is performed by analysing, on three different days, the following samples sequence: two whites (one analyzed with HCl 0.02N, while the other with HCl 0.10N), a wastewater sample (since knowing its concentration will allow a later on calculation of recovery in every concentration level), a low concentration level sample (ad1 sample), a medium concentration level sample (ad2 sample) and a high concentration level sample (ad3 sample), getting the following results:

(Press the image to ampliate)

Table 3. Results obtained in three different days.

Below you can find the recovery data analysis obtained according to the concentration level, the analysis day and globally.

Low level
(ad1 sample)
Medium level (ad2 sample)
High level
(ad3 sample)
97.5 99.0 98.3 98.2
3.6 1.2 0.8 2.0
3.7 1.3 0.8 2.1

Table 4. Statistical parameters according to the concentration level studied.


To study the quantification limit, we work with ammonium sulphate standards, tritant reagent HCl 0.02 N and three replicates are made. Results obtained are shown in the following table:

Nominal value
Experimental values
N/ mg
HCl/ mL
N / mg
white 0.26 --------- --------- ---------
0.1 0.59 0.09 90.6 11.71
0.2 0.91 0.18 90.6 4.09
0.5 2.05 0.50 99.9 1.80

Table 5. Results obtained for the equipment quantification limit determination.

From these data we conclude that the equipment quantifies with a satisfactory accuracy and precision from 0.5mg of Nitrogen. Bearing in mind that the usual sample volume is 50mL, the equipment quantification limit is set to 10mg N/L.

When working with samples, the lowest concentration level studied (ad1 sample) has been of 20mg/L, so when using a sample volume of 50 mL, this means that the equipment quantifies around 1 mg N.


From the validation results obtained, uncertainty (u) is calculated associated to analysis, to each concentration level, by using the following formula: (4)

(Press the image to ampliate)

Expanded uncertainty (u) is calculated associated to analysis, as U=k*u, with a coverage factor of k=1.96 for a significance level of 95%.

So, the result of an analysis can be expressed as x ± U*x / 100.

The following table shows the uncertainty calculation values for each concentration level studied:

Concentration level
u standard /%
u accuracy/%
u precision /%
U (k=1.96)/%
Low level
0.29 2.48 3.67 4.44 8.7
Medium level
0.29 1.02 1.26 1.65 3.2
High level
0.29 1.74 0.80 1.93 3.8

Table 6.


A wastewater sample has been tested from a comparison between laboratories. A couple of blanks and four repetitions of the sample have been tested on the same day and under the same operating conditions, according to the procedure described in paragraph 3, using a sample volume of 50mL and as a tritant reagent HCl 0.05 N, with the results shown below:

Tritant reagent volume/ mL
Concentration/ mgN.L-1
0.10 --------
0.08 --------
Replication nº1
1.99 26.61
Replication nº2
1.83 24.37
Replication nº3
1.98 26.47
Replication nº4
1.85 24.65

Table 7. Water analysis results from a comparison between laboratories.

Then, the results obtained are compared to the results provided in the comparative between laboratories.

Results obtained
Result between laboratories (*)
Average/ mgL-1
25.5 27.0 94.4
S/ mgL-1
1.18 3.27
CV/ %
4.62 12.1

Table 8.

(*) Circuit Calitax. Agencia Catalana de l’aigua. October 2002

According to the uncertainty calculation made in the previous section (low concentration level), the result obtained in this analysis can be expressed as 25.5 ± 2.2 mg N.L-1.


1. The equipment provides satisfactory results working with standards in the range between 0.5 and 200 mg of Nitrogen, with recovery values between 97 and 103 %.
2. The accuracy of the analysis method applied to wastewaters is considered satisfactory, as recoveries between 95 and 102% are obtained.
3. The method intermediate precision is also considered satisfactory, since we obtain variation coefficient values of recoveries lower than 5% in all cases. It should also be noted that in medium and high concentration levels, these variation coefficient values are lower than 2%.
4. A result of 25.5 ± 2.2 mg N.L-1 has been obtained in the water analysis from the comparison between laboratories. This range includes the value 27.0 mg N.L-1 considered true.
5. The JP Selecta Automatic Distiller PRONITRO “A” is an easy to use and maintenance equipment, and saves time in Nitrogen determinations by Kjeldahl method.


(1) Thiex, N.J., Manson, H., Anderson, S., Persson, Determinacion of crude protein in Animal Feed, Forage, Grain, and Oilseeds by Using Block Digestion with a Copper Catalyst and Steam Distillation into Boric Acid: Collaborative Study, Journal of AOAC International, 85, 2, 309-317 (2002)
Ogg, Clyde L., Treatise on analytical chemistry: edited by I.M.Kolthoff and Philip J.Elving with the assistance of B.Sandell, Vol x. Part 2. Kjeldahl Method, ………John Wiley and Sons, New York
JP Selecta, JP Selecta Automatic Distiller PRONITRO “A” Instructions Manual (2006)
IQS internal procedure.
Several authors, 2001, Validación de métodos analíticos, AEFI, Barcelona.
Miller, J.N., Miller, J.C., 2002, Estadística y quimiometría para química analítica, 4th edition, Ed. Prentice Hall, Madrid.

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  5. hola tengo una pequena duda… es necesario en la digestion eliminar toda el agua para proceder a la destilacion???

    • Hola Tobby,

      Referente a su pregunta acerca de si es necesario en la digestión eliminar toda el agua para proceder a la destilación, SI es necesario porque para hacer la digestión tenemos que elevar la muestra hasta 400 ºC y si no hemos eliminado previamente toda el agua, al aumentar la temperatura, se producirían ebulliciones violentas o pequeñas explosiones que podrían hacer que se mezclaran muestras entre sí estropeando todo el análisis e incluso podrían salpicar el equipo deteriorándolo.

      Una programación que podría ser adecuada para muestra de agua es:

      Digestión: aguas

      100 ml de muestra
      15 ml H2SO4 para hacer la digestión
      1 pastilla de catalitzador (8gr. 2 pastillas si son de 4gr)
      200 minutos a 160º C
      30 minutos a 180º C
      30 minutos a 300º C
      1 h a 400º C

      Muchas gracias por su pregunta, espero que le sirva.

      Grupo Selecta

  6. Hola, tengo una pregunta, quisiera saber si hay alguna manera de separar el nitrogeno organico y el nitrogeno amoniacal o si es podible determinarlos por separado.

    • Hola Cristian,

      Referente a su pregunta, no es posible determinarlos por separado pero sí es posible determinar únicamente el amoniacal, después amoniacal y nítrico y después el total.

      De esta manera tendríamos:

      N amoniacal = N (a)
      N nítrico = N(n)
      N nítrico + amoniacal = N (n+a)
      N total = N (t)
      N orgánico = N (o)

      Espero que le sirva.

      Grupo Selecta

  7. Buenos días:
    Sabría alguno de los presentes si existe alguna validación publicada para un método potenciométrico con valoración automática. Gracias

    • Si lo que quiere validar es el método Kjeldahl completo (incluyendo la digestión) puede utilizar el patrón de Acetanilida tal y como se explica en las notas de aplicaciones.
      Si únicamente quiere validar el destilador utilizar el patrón de Sulfato de Amonio.
      En definitiva lo que queremos validar es un proceso.
      Tenemos una entrada (nuestro patrón) y una salida (el resultado de la valoración) Tenemos que comprobar que el resultado de la salida está dentro de la tolerancia que admitimos.
      En nuestro caso, con el proceso completo, la entrada es la masa de Acetanilida (mg) y la salida es la cantidad de Nitrógeno recuperada.
      Como conocemos previamente la cantidad de Nitrógeno que contiene nuestra muestra patrón (Acetanilida) comparamos con el Nitrógeno recuperado y el proceso queda validado si está dentro de la tolerancia que admitimos.
      El método de valoración potenciométrico o colorimétrico no tiene importancia . El proceso queda validado lo que significa que los diferentes subprocesos (digestión, destilación y valoración) se están realizando adecuadamente.

  8. Buenas tardes,

    Si quiero validar con el patrón de sulfato de amonio, ¿cuál sería mi intervalo de recuperación de referencia? siempre es 97-103 % ó cuales otros aplicarían?

  9. Hola, en caso de determinar proteinas por este metodo que estandares recomiendan emplear

    • Buenos días,
      Si a lo que se refiere es que utilizar como patrón para la validación del método, son los que se indica en el artículo.
      Amonio sulfato para validación del destilador.
      Acatanilida para la validación de todo el proceso.




        • Buenos días,

          Me remito de nuevo a lo expuesto en el artículo, se trata del método oficial para la determinación del nitrógeno orgánico.
          En el caso de proteínas en alimentos, la cantidad de nitrógeno orgánico que no proceden de las proteínas es ínfima comparada a la que procede de las proteínas. Es por esta razón que se considera una “buen aproximación” y está aceptado por la mayoría de organismos oficiales como método oficial para la determinación de proteínas..
          En muestras que contengan nitrógeno no orgánico (nitritos, nitratos, nitrógeno amoniacal,…) en cantidades más elevadas, hay que realizar procesos previos para poder hacer esa diferenciación.
          En resumen, el método Kjeldahl es especifico para nitrógeno orgánico.



  10. cordial saludo

    voy a empesar la validacion para proteina en alimentos por este mismo metodo quisiera saber que me recomiendan y como empesar a realizarla, y los patrones a que concentracion debo hacerla, ya que no he echo ninguna validacion antes

    muchas gracias

  11. perdon empezar

  12. Quiere validar es el método Kjeldahl completo incluyendo la digestión puedo utilizar el patrón de Acetanilida o sulfato de amonio. Quiero validar el destilador utilizar el patrón de Sulfato de Amonio, también quiero validar el proceso de la digestión con Acetanilida.
    El tema es que con la acetanilida no puedo recuperar el 98 % como mínimo
    Preguntas: 1) Cuanto de temperatura inicial debo utilizar en el Block de digestión y en cada cuanto tiempo debo ir aumentando las temperaturas.
    2) Que cantidad de hidróxido de sodio al 32% debo adicionar a la muestra cuando se destila en un equipo automático y la cantidad de agua
    Gonzalo E

  13. Buenas tardes a todos,
    la recuperación de 99 y 101% es válido para concentraciones de 0.2mg??. he realizado varias pruebas a 0.2 y 0.5 mg pero no he conseguido la recuperación entre 99 y 101%.


    • “Hola buenos días.
      No, la recuperación del 99 – 101 % es sobre muestras (o patrones) con un contenido superior a 5 mg.
      Piense que en el equipo tiene un error absoluto que en muestras de contenido tan bajo hacer que el error relativo sea muy grande.

  14. Hola una consulta, ¿es lo mismo para muestras de caliche en vez de muestras de aguas residuales? Y lo segundo ¿como se calibra el equipo? ¿con que y para que?

    • “Hola no tenemos muy claro a que te refieres con “caliche”. En principio para cada tipo de muestra se pueden programar tiempos de digestión diferentes pero en general el proceso es igual.
      Con respecto a la calibración supongo que se refiere a la verificación/validación del método.
      En nuestra web, en determinación de proteínas por el método Kjeldahl se explica cómo comprobar el funcionamiento del destilador en el apartado:
      Y como validar el proceso completo en el apartado:

  15. Hola

    Muy interesante el soporte que brindan, gracias por ello. Tengo una inquietud y es que trabajo con un pro Nitro-S y quiero saber que hacer cuando el equipo no recupera mas de 95 %. El manual de manufacturero dice que debe ser de 99 a 101.5 % y asumo que si no obtengo ese porcentaje de recuperacion, mi analisis de muestras (cereales y harinas carnicas) no sera eficiente.

    Gracias por su ayuda

    • Respostra:
      ” Hola buenos días.
      Hay muchas causas que puede provocar pérdidas en la recuperación, algún tipo de error en el proceso de digestión, la cantidad de sosa añadida para la destilación, fugas en el equipo de destilación, contaminación de reactivos, errores en la normalidad del ácido de valoración,…..
      Nuestro consejo es que intente primero determinar la causa.
      Pruebe a realizar la pruebas de verificación del destilador con amonio sulfato como indicamos en esta página

      Para asegurarse de que el equipo funciona correctamente.
      Si es así debe buscar la causas de las perdidas en otra parte del proceso.
      Si el resultado no es correcto debería buscar la causa en alguna fuga del equipo o en el ácido de valoración.

  16. hola que tal?, quería consultarles algunas cosas.
    1) El intervalo de linealidad no esta hecho hasta 1000mg/L, esto se debe a que era tedioso porque hay varias linealidades?
    2) En el ejercicio interlaboratorio cuantos laboratorios participaron?
    3) En el calculo de incertidumbre de exactitud solo se tuvo en cuenta la pureza del patrón, por que no la pesada?
    4) Como se realiza la titulación, es decir es necesario un operario que verifique el viraje del indicador o lo realiza el equipo?

    • “Buenos días.
      Este estudio fue realizado por el IQS hace algunos años y no tenemos todos los datos disponibles en este momento.
      Aun así vamos a intentar responder a sus preguntas.

      1 .- En el estudio de la linealidad se utilizaron patrones de sulfato de amonio de entre 0.5 y 200 mg de nitrógeno. Al suponer muestras con un contenido 1000 mg N / l si la cantidad de muestra analizada es de 50 ml , la cantidad de nitrógeno que deberíamos detectar es de 50 mg N que está dentro de estudio de la linealiada.

      2 .- No sabemos a que se refiere sobre el ejercicio interlaboratorios.

      3 .- Tampoco tenemos este dato ya que como le comentaba el estudio fue realizado por el IQS

      4 .- En este caso el equipo utilizado, Pronitro A, es de valoración automática y destila y valora a la vez dando al final el resultado. Sin embargo se puede utilizar un Pronitro M o S y el procedimiento sigue siendo el mismo pero al ser la valoración manual (hecha por un operario) los cálculos de incertidumbre, el límite de cuantificación, etc ya no serían válidos.

  17. ¿CUAL SERÍA EL PROCEDIMIENTO (cantidades de muestra y reactivos) PARA EL análisis de nitrógeno total y amoniacal en aguas pero usando un equipo pronitro M?
    ¿Existe algún método normalizado para las cantidades usadas en ese equipo?
    un saludo

    • “Buenos días.
      No disponemos de un método normalizado pero si podemos darle alguna información a modo de orientación:

      Contenido de nitrógeno esperado (mg / L) 0-1 Cantidad de muestra (mL) 500
      Contenido de nitrógeno esperado (mg / L) 1-10 Cantidad de muestra (mL) 250
      Contenido de nitrógeno esperado (mg / L) 10-20 Cantidad de muestra (mL) 100
      Contenido de nitrógeno esperado (mg / L) 20-50 Cantidad de muestra (mL) 50,0
      Contenido de nitrógeno esperado (mg / L) 50- 100 Cantidad de muestra (mL) 25,0

      Tenga en cuenta que es indispensable evaporar la mayor parte del agua antes de comenzar la digestión.
      En muestras con contenido inferior no igual a 100 mL se puede hacer en el mismo bloque digestor y en los tubos de muestra poniendo un primer paso a 165ºC aproximadamente.
      El tiempo debe ser suficiente para evaporar el agua, por ejemplo para 100 mL de muestra podrían ser necesarias 4-5 horas.
      Las muestras de más de 100 mL deben evaporar una cantidad suficiente de agua utilizando otro sistema y seguidamente traspasar la muestra restante a los tubos de digestión.
      Las cantidades de reactivos son iguales a las que utilizaría en muestras sólidas con la misma cantidad de nitrógeno esperada.

  18. hola me podrias ayudar indicandome cual es el valor de nitrogeno del sulfato de amonio, estoy realizando nitrogeno total en agua ..con 100ml de muestra q la llevo a ebullicion hasta q quede aproximadamente 25 ml de muestra dejo enfriar y coloco en el tubo junto a catalizadores 7.5 gr de sulfato de potasio y 0.4 gr oxido mercurio y 15 ml de acido sulfurico y lo coloco en el digestor a dos temperaturas la primera por media hr y la segunda x 40 min , una vez digestido y enfriado coloco 30 ml de agua y quiero pasar un patro de acetanilida pero no se cuanto pesar titulo mis muestras de agua con acido sulfurico 0.02N ESTANDARIZADO Y mi receptor es acido borico al 2%, indicador mixto, mi pregunta es para realizar los dos patrones y verificar mi proceso cuanto debo de pesar en acetanilida y sulfato de amonio y que %de nitrogeno tienen ambos para el calculo de recuperacion de ambos para obtener mi veracidad en mi metodo?
    si mal no recuerdo creo que en proteina la acetanilida tiene %N=10
    ayudame por favor con mis dudas

  19. Buenas,en mi empresa tengo un equipo Kjeldahl Nitro-Pro A.Por problemas ajenos a mi voluntad se extravió el disco de instalación del equipo y no podemos hacer los análisis necesarios.Tengo el catálogo del equipo pero necesito con mas detalles los pasos para su instalación.Por favor necesito de su colaboración para la puesta en marcha del equipo y la funcionalidad total del laboratorio.Gracias por la atención.

  20. “(…) para la determinación de lo que se conoce como “nitrógeno Kjeldahl”, que proporciona el contenido de nitrógeno orgánico más nitrógeno amoniacal de una muestra.”

    Buenas tardes, según lo citado en el artículo, este método sirve para cuantificar el Nitrógeno total (nitrógeno orgánico+nitrógeno amoniacal), quisiera saber por favor, si es posible y de qué manera, cuantificar nitrógeno orgánico y nitrógeno amoniacal por separado con este método.


    • “ Hola buenas tardes.
      Efectivamente el método kjeldahl se utiliza para la determinación del nitrógeno total.
      Para determinar el nitrógeno amoniacal debe utilizar otro método, por ejemplo el del óxido de magnesio. Desconocemos si existe alguno más.

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