Notas de Aplicaciones
13ene/15

Determinacion de las constantes cineticas de la fosfatasa acida de germen de trigo y efecto del pH sobre su actividad.

Determinación de las constantes cinéticas de la fosfatasa ácida de germen de trigo y efecto del pH sobre su actividad.

Estudio realizado por el Institut Químic de Sarrià.

1. OBJETIVOS

  • Determinación de la actividad enzimática de la fosfatasa ácida de germen de trigo mediante un método colorimétrico discontinuo.
  • Estudio del efecto del pH sobre su actividad.
  • Determinación de la constante de Michaelis (KM) para el p-nitrofenil-fosfato (pNPP), la velocidad máxima (Vmax), y la constante de inhibición (Ki) por fosfato de la fosfatasa.

2. INTRODUCCIÓN

La cinética enzimática estudia la velocidad de las reacciones químicas que son catalizadas por las enzimas (E). Para muchos enzimas que catalizan reacciones con un único sustrato (S), la velocidad de catálisis (V) (moles de producto (P) formado por segundo) varía de forma no lineal con la concentración de sustrato [S], siguiendo una cinética de saturación por sustrato de tipo Michaelis-Menten. La ecuación de Michaelis-Menten (V = Vmax S / (KM + S)) define el comportamiento cinético de estas enzimas. La constante de Michaelis KM se define como la concentración de sustrato [S] a la que la velocidad de la reacción enzimática es la mitad de la Vmax (cuando [S] = KM, entonces V = Vmax / 2). Cuando la [S] es mucho menor que la KM ([S]<<KM), la velocidad de la reacción incrementa de forma lineal con la [S]. Cuando la [S] es mucho mayor que la KM ([S]>>KM), entonces la velocidad es independiente de la [S] y V = Vmax. El valor de KM no sólo es variable en función de la naturaleza de la enzima y del sustrato, sino que también depende de las condiciones de temperatura y pH de la reacción.

Una forma tradicional de calcular los valores de KM y Vmax a partir de datos experimentales consiste en representar gráficamente los inversos de las concentraciones mM de sustrato (eje de abscisas) vs los inversos de la velocidad (eje de ordenadas) (representación de dobles inversos o Lineweaver-Burk). Esta representación de los puntos sigue una recta definida por la ecuación de Lineweaver-Burk (que se deriva de la ecuación de Michaelis-Menten) del tipo “y = mx + c”. A partir de los puntos de intersección de la recta de Lineweaver-Burk con el eje de la X y con el eje de la Y, se puede calcular los valores de KM y Vmax, respectivamente.

La inhibición enzimática se define como la disminución de la velocidad de la reacción catalizada por una enzima debido a la presencia de un inhibidor (I). Los inhibidores pueden actuar alterando los parámetros cinéticos (KM y Vmax), de forma que los valores observados en presencia del inhibidor se denominan KM aparente (KM-ap) y Vmax aparente (Vmax-ap). Las enzimas pueden inhibirse reversiblemente de forma competitiva y no competitiva. Los inhibidores competitivos se unen a la enzima impidiendo la unión del sustrato. Esto conlleva un incremento en la KM en presencia del inhibidor (KM-ap > KM), mientras que la Vmax se mantiene constante. Los inhibidores no competitivos se unen a un sitio regulador distinto al centro activo, y actúan disminuyendo la velocidad máxima (Vmax) de la reacción catalizada por la enzima (Vmax-ap < Vmax) sin alterar la KM (puesto que no alteran la unión de la enzima al sustrato). Consecuentemente, en la inhibición competitiva se observa una disminución del porcentaje de inhibición al incrementar la concentración de sustrato en la reacción, mientras que en la no competitiva el porcentaje de inhibición permanece constante. La constante de inhibición (Ki) mide la afinidad de la enzima por el inhibidor. En el caso de la inhibición competitiva, la Ki se puede deducir a partir de la KM y la KM-ap: KM-ap = KM {1 + ([I] / Ki )}

Las fosfatasas son una familia de enzimas que catalizan la hidrólisis de un grupo fosfato (desfosforilación). Su actividad es sensible al pH del medio, de forma que las fosfatasas alcalinas funcionan de forma óptima en condiciones de pH alcalino, mientras que las fosfatasas ácidas lo hacen en ambientes ácidos. La actividad fosfatasa se puede medir mediante un ensayo enzimático colorimétrico basado en su capacidad de hidrólisis del p-nitrofenilfosfato (pNPP) a p-nitrofenol: p-nitrofenilfosfato (pNPP) + H2O → p-nitrofenol + fosfato.

A diferencia del pNPP, el  producto de la reacción p-nitrofenol es un compuesto amarillo que presenta un máximo de absorbancia a 405 nm en un medio alcalino que se puede monitorizar mediante espectrofotometría.

En este ensayo se determinará la actividad fosfatasa ácida de un preparado de germen de trigo, y se ensayará cómo esta actividad se ve afectada por cambios en el pH y en la [S], y por la presencia de un inhibidor. Por un lado, se ensayará la actividad fosfatasa en distintas condiciones de pH y se determinará el pH óptimo. Por otro, se determinará la actividad fosfatasa a pH óptimo en presencia de distintas concentraciones de pNPP y de fosfato inorgánico, un inhibidor reversible de la fosfatasa, y se determinará las constantes cinéticas KM, Vmax, KM-ap, Vmax-ap y Ki.

3. CONCEPTOS BÁSICOS

  • Ensayo enzimático colorimétrico discontinuo
    • ε = Coeficiente de extinción molar
    • Abs = Absorbancia
    • c = Concentración
    • l = Longitud del paso de luz (path length) (cm)
  • Unidades de actividad enzimática (U, µmol/min), actividad específica (U/mg) y concentración enzimática (U/ml)
  • Representación y ecuación de Michaelis-Menten y de Lineweaver-Burk
  • Velocidad de catálisis (V), velocidad máxima (Vmax) y constante de Michaelis-Menten (KM)
  • Inhibición reversible competitiva y no competitiva
  • KM aparente (KM-ap), Vmax aparente (Vmax-ap) y constante de inhibición (Ki)
  • Ecuación de Lambert-Beer:   Abs = ε · c · l

4. MATERIAL Y REACTIVOS

  • Selecta Spectrophotometer UV-3100. Código 4120021
  • Selecta PH Meter PH-2006. Código 4120600
  • Selecta Microcentrífuga Sigma 1-14. Código 5710014
  • Selecta Vórtex Heidolph Reax Top. Código 5411000
  • Selecta Baño termostático Precisterm. Código 6000387
  • Selecta Agitador magnético  Agimatic-E. Código 7002431
  • Balanza analítica. Código 5830039  
  • Micropipetas.
  • Germen de trigo
  • Ácido cítrico monohidrato
  • p-nitrofenil-fosfato (pNPP)
  • Citrato de trisodio dihidratado
  • Tris-base
  • Ácido clorhídrico
  • Carbonato de sodio
  • Fosfato monopotásico

5. PROCEDIMIENTO

1. PREPARACIÓN DE TAMPONES Y DISOLUCIONES.

Con la ayuda del Selecta PH Meter PH-2006 y del Selecta Agitador magnético con placa calefactora Agimatic-E, preparar las siguientes disoluciones.

1.1.  Preparación de tampones citrato 0,2 M a pH 3, 4, 5 y 6.

1.1.1.     Preparar tampón citrato 0,2 M a pH 3, 4, 5 y 6 mezclando las siguientes soluciones stock en las proporciones adecuadas:

  • Solución A: Ácido cítrico monohidrato 0,2 M en agua desionizada.
  • Solución B: Citrato de trisodio dihidratado 0,2 M en agua desionizada.

1.2.  Preparación de tampones tris 0,2 M a pH 7, 8, y 9. 1.2.1. Preparar tampón tris 0,2 M a pH 7, 8 y 9 utilizando tris-base y ajustando el pH con ácido clorhídrico 6 N.

1.3.  Preparación de carbonato de sodio 0,1 M en agua desionizada.

1.4.  Preparación de fosfato monopotásico 50 mM en agua desionizada.

2. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD FOSFATASA DE GERMEN DE TRIGO. Se ensayará la actividad fosfatasa ácida de un producto parcialmente purificado de germen de trigo. Para ajustar las condiciones del ensayo, se testarán distintas diluciones de la muestra y distintos tiempos de reacción. NOTA: Para preservar la actividad fosfatasa, mantener la muestra stock y las respectivas diluciones en hielo.

2.1.  A partir del preparado de germen de trigo, preparar el siguiente banco de diluciones en agua:

  • 0,5 ml a 1 mg/ml
  • 0,5 ml a 0,5 mg/ml
  • 0,5 ml a 0,25 mg/ml
  • 0,5 ml a 0,125 mg/ml
  • 0,5 ml a 0,05 mg/ml

2.2.  Con la ayuda del Selecta Vórtex Heidolph Reax Top, en un tubo Eppendorf, preparar 1 ml de 50 mM p-nitrofenil-fosfato (pNPP) en agua desionizada. NOTA: El pNPP es muy lábil, y se debe preparar fresco y mantener protegido de la luz.

2.3.  Numerar 16 tubos Eppendorf y añadir los siguientes reactivos:

Tubo Agua Tampón citrato 0,2M pH 5 Germen de trigo
Blanco 200 µl - -
1.1 25 µl 125 µl 50 µl 1 mg/ml
2.1 25 µl 125 µl 50 µl 0,5 mg/ml
3.1 25 µl 125 µl 50 µl 0,25 mg/ml
4.1 25 µl 125 µl 50 µl 0,125 mg/ml
5.1 25 µl 125 µl 50 µl 0,05 mg/ml
1.2 25 µl 125 µl 50 µl 1 mg/ml
2.2 25 µl 125 µl 50 µl 0,5 mg/ml
3.2 25 µl 125 µl 50 µl 0,25 mg/ml
4.2 25 µl 125 µl 50 µl 0,125 mg/ml
5.2 25 µl 125 µl 50 µl 0,05 mg/ml
1.3 25 µl 125 µl 50 µl 1 mg/ml
2.3 25 µl 125 µl 50 µl 0,5 mg/ml
3.3 25 µl 125 µl 50 µl 0,25 mg/ml
4.3 25 µl 125 µl 50 µl 0,125 mg/ml
5.3 25 µl 125 µl 50 µl 0,05 mg/ml

NOTA: Se testará la actividad fosfatasa en cada una de las 5 diluciones de la muestra y en tres tiempos de reacción (10, 15 y 20 min).

2.4.  Mezclar los tubos suavemente, y con la ayuda de la Selecta Microcentrífuga Sigma 1-14, centrifugar brevemente.

2.5.  Preincubar los tubos a 37ºC en el Selecta Baño termostático Precisterm.

2.6.  Iniciar la reacción añadiendo 50 µl de pNPP 50 mM a cada tubo, siguiendo el mismo orden que se indica en la tabla, y con un intervalo de 30 s entre tubo y tubo. Mezclar brevemente con el Selecta Vórtex Heidolph Reax Top tras iniciar la reacción en cada tubo, e incubar a 37 ºC en el Selecta Baño termostático Precisterm.

2.7.  Dejar transcurrir la reacción durante 10 min exactos para los tubos 1.1-5.1, 15 min exactos para los tubos 1.2-5.2, y 20 min exactos para los tubos 1.3-5.3.

2.8.  Añadir 750 µl carbonato de sodio (Na2CO3) 0,1 M a cada tubo para detener la reacción a los tiempos indicados, también a intervalos de 30 s entre tubo y tubo y siguiendo el mismo orden. Mezclar por inversión.

2.9.  Transferir el volumen a una cubeta de espectrofotómetro y medir la absorbancia a 405 nm (A405) de cada una de las reacciones respecto la del blanco en el Selecta Spectrophotometer UV-3100.

2.10.  Para cada dilución de la muestra, representar gráficamente la A405 (eje Y) en función del tiempo de reacción (eje X).

2.11.  Calcular los µmoles totales de p-nitrofenol liberados a tiempo 15 min para cada una de las diluciones de muestra ensayada, utilizando la ecuación de Lambert-Beer y considerando que el coeficiente de extinción molar del p-nitrofenol es de ε =18.000 M−1 cm−1.

2.12.  Calcular las unidades de actividad fosfatasa (U, µmol/min) en cada una de las diluciones de muestra ensayada (a tiempo 15 min). Representar gráficamente la actividad fosfatasa (eje Y) en función de la concentración de las muestras ensayadas (eje X).

2.13.  Para aquellas diluciones de muestra que respondan dentro del rango lineal (a tiempo 15 min), calcular la concentración de actividad fosfatasa (U/ml), y la actividad fosfatasa por mg de preparado de germen de trigo (U/mg).

3. EFECTO DEL PH SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA FOSFATASA. Se ensayará la actividad fosfatasa a distintos pH entre 3 y 9. Para ello, se utilizará los tampones citrato 0,2 M a pH 3, 4, 5 y 6, y los tampones tris 0,2 M a pH 7, 8 y 9.

3.1.  En función de los resultados obtenidos en el punto 2, preparar una dilución de germen de trigo adecuada para el ensayo, y mantener en hielo.

3.2.  Con la ayuda del Selecta Vórtex Heidolph Reax Top, en un tubo Eppendorf preparar 1 ml de 50 mM p-nitrofenil-fosfato (pNPP) en agua desionizada.

3.3.  Numerar 8 tubos Eppendorf y añadir los siguientes reactivos:

Tubo Agua Tampón 0,2M Dilución de germen de trigo
Blanco 200 µl - -
1 25 µl 125 µl  pH = 3 50 µl
2 25 µl 125 µl  pH = 4 50 µl
3 25 µl 125 µl  pH = 5 50 µl
4 25 µl 125 µl  pH = 6 50 µl
5 25 µl 125 µl  pH = 7 50 µl
6 25 µl 125 µl  pH = 8 50 µl
7 25 µl 125 µl  pH = 9 50 µl

3.4  Mezclar los tubos suavemente, y con la ayuda de la Selecta Microcentrífuga Sigma 1-14, centrifugar brevemente.

3.5.  Preincubar los tubos a 37ºC en el Selecta Baño termostático Precisterm.

3.6.  Iniciar la reacción añadiendo 50 µl de pNPP 50 mM a cada tubo, siguiendo el mismo orden que se indica en la tabla, y con un intervalo de 30 s entre tubo y tubo. Mezclar brevemente con el Selecta Vórtex Heidolph Reax Top tras iniciar la reacción en cada tubo, e incubar a 37 ºC en el Selecta Baño termostático Precisterm.

3.7.  Dejar transcurrir la reacción a 37 ºC durante 15 min exactos.

3.8.  Añadir 750 µl carbonato de sodio (Na2CO3) 0,1 M a cada tubo para detener la reacción, también a intervalos de 30 s y siguiendo el mismo orden. Mezclar por inversión.

3.9.  Transferir el volumen a una cubeta de espectrofotómetro y medir la absorbancia a 405 nm (A405) de cada una de las reacciones respecto la del blanco en el Selecta Spectrophotometer UV-3100.

3.10.  Determinar los μmoles de p-nitrofenol producidos en cada reacción a partir de la ecuación de Lambert-Beer y el coeficiente de extinción molar del p-nitrofenol.

3.11.  Calcular las unidades de actividad enzimática (U, μmol/min) fosfatasa en cada una de las condiciones de pH ensayado.

3.12.  Representar gráficamente los resultados situando la actividad enzimática en el eje Y y el pH en el eje X.

4. DETERMINACIÓN DE LAS CONSTANTES CINÉTICAS DE LA FOSFATASA: KM PARA EL P-NITROFENIL-FOSFATO Y Ki PARA LA INHIBICIÓN POR FOSFATO. Para calcular la constante de Michaelis (KM) de la fosfatasa para el p-nitrofenil-fosfato, se determina la actividad de la enzima en distintas concentraciones de sustrato. La constante de inhibición (Ki) por fosfato se determina de la misma manera pero en presencia de una concentración constante del inhibidor fosfato.

4.1.  En función de los resultados obtenidos en el punto 2, preparar una dilución de germen de trigo adecuada para el ensayo, y mantener en hielo.

4.2.  Con la ayuda del Selecta Vórtex Heidolph Reax Top, preparar 1 ml de p-nitrofenil-fosfato (pNPP) 80 mM y 500 µl de pNPP 8 mM en tampón citrato 0,2 M pH 5.

4.3.  Numerar 17 tubos Eppendorf y añadir los siguientes reactivos:

Tubo Tampón citrato 0,2M pH=5 pNPP Agua KH2PO4 50 mM
Blanco 112,5 µl 12,5 μl de 80 mM 125 µl -
1 112,5 µl 12,5 μl   de 8 mM 75 µl -
2 100 µl 25 μl   de 8 mM 75 µl -
3 75 µl 50 μl   de 8 mM 75 µl -
4 50 µl 75 μl   de 8 mM 75 µl -
5 112,5 µl 12,5 μl de 80 mM 75 µl -
6 100 µl 25 μl de 80 mM 75 µl -
7 75 µl 50 μl de 80 mM 75 µl -
8 50 µl 75 μl de 80 mM 75 µl -
9 112,5 µl 12,5 μl   de 8 mM 25 µl 50 µl
10 100 µl 25 μl   de 8 mM 25 µl 50 µl
11 75 µl 50 μl   de 8 mM 25 µl 50 µl
12 50 µl 75 μl   de 8 mM 25 µl 50 µl
13 112,5 µl 12,5 μl de 80 mM 25 µl 50 µl
14 100 µl 25 μl de 80 mM 25 µl 50 µl
15 75 µl 50 μl de 80 mM 25 µl 50 µl
16 50 µl 75 μl de 80 mM 25 µl 50 µl

4.4.  Mezclar los tubos suavemente, y con la ayuda de la Selecta Microcentrífuga Sigma 1-14, centrifugar brevemente.

4.5.  Preincubar los tubos a 37ºC en el Selecta Baño termostático Precisterm.

4.6.  Iniciar la reacción añadiendo 50 µl de la dilución de germen de trigo a cada tubo excepto el blanco, siguiendo el mismo orden que se indica en la tabla, y con un intervalo de 30 s entre tubo y tubo. Mezclar brevemente con el Selecta Vórtex Heidolph Reax Top tras iniciar la reacción en cada tubo, e incubar a 37 ºC en el Selecta Baño termostático Precisterm.

4.7.  Dejar transcurrir la reacción a 37ºC durante 15 min exactos.

4.8.  Añadir 750 µl carbonato de sodio (Na2CO3) 0,1 M a cada tubo para detener la reacción, también a intervalos de 30 s y siguiendo el mismo orden. Mezclar por inversión.

4.9.  Anotar los valores de A405 y para cada reacción, calcular los siguientes parámetros:

  • Concentración inicial de sustrato [S] pNPP en mM.
  • Concentración de inhibidor [I] fosfato en mM.
  • Los μmoles de p-nitrofenol producidos en cada reacción a partir de la ecuación de Lambert-Beer y el coeficiente de extinción molar del p-nitrofenol.
  • La velocidad (V) de reacción: μmoles de p-nitrofenol liberados por minuto (μmol/min).
  • El % inhibición producida por el fosfato para cada concentración de sustrato.
    • % Actividad = (V con inhibidor / V sin inhibidor) x 100
    • % Inhibición = 100 - % Actividad
  • La inversa de la concentración inicial de sustrato (1/[S]) y de la velocidad de reacción (1/V).

4.10.  Representar gráficamente la curva de Michaelis-Menten de concentración de sustrato (eje de la X) vs velocidad (eje de la Y), con y sin inhibidor.

4.11.  Representar gráficamente los inversos de las concentraciones mM de sustrato (eje de la X) vs los inversos de la velocidad (eje la Y), con y sin inhibidor (representación de dobles inversos o Lineweaver-Burk).

4.12.  A partir de los puntos de intersección de la recta de Lineweaver-Burk con el eje de la X y con el eje de la Y, calcular los valores de KM (mM) y la Vmax (µmol/min), respectivamente, en ausencia del inhibidor. Estos valores se pueden deducir por extrapolación a partir de la regresión lineal:

4.12.1.     Cuando y = 0, KM = -1/x. 4.12.2.     Cuando x = 0, Vmax = 1/y.

4.13.     De forma equivalente, a partir de la representación de Lineweaver-Burk calcular los valores de KM aparente (KM-ap) y de Vmax aparente (Vmax-ap) de la enzima en presencia del inhibidor fosfato.

4.14.     En base a los datos de % de inhibición por fosfato y de las variaciones entre KM y KM-ap, y Vmax y Vmax-ap, determinar si la inhibición de la fosfatasa por fosfato es competitiva o no competitiva.

4.15.     En el caso de que la inhibición sea de tipo competitiva, calcular el valor de la constante de inhibición (Ki) (mM) de la fosfatasa por fosfato a partir de la KM, KM-ap, y [I].

6. BIBLIOGRAFÍA

  • BIOQUÍMICA 7ED. L. Stryer / J. Berg / J. Tymoczko.
  • Brouillard, J., and Quellet, L. (1965). Acid phosphatases of wheat germ. Chromatographic analysis. Can. J. Biochem., 43, 1899-1905.
  • Waymack, P.P., and van Etten, R.L. (1991). Isolation and characterization of a homogeneous isoenzyme of wheat germ acid phosphatase. Arch. Biochem.Biophys., 288, 621-33.
10oct/12

METODO KJELDAHL / KJELDAHL METHOD

El método Kjeldahl se utiliza en química analítica para la determinación del contenido de nitrógeno en muestras orgánicas lo cual es de gran interés en ámbitos de tanta transcendencia hoy en día como son el alimentario y el medioambiental.

APLICACIONES
Desde 1883 en que John Kjeldahl presentó sus trabajos, su método ha ganado una gran aceptación y se aplica en una amplia variedad de trabajos para los análisis de alimentos, bebidas, piensos, grano, carnes, aguas residuales, suelos para cultivos y otros. Hoy por hoy es el método más usado para el análisis de proteínas y se efectúa mediante la determinación de nitrógeno orgánico. Esto es así porque los diferentes tipos de proteínas coinciden todas ellas en una proporción similar de dicho nitrógeno orgánico. En la mayoría de los casos de utiliza el factor de cálculo siguiente:

Contenido de proteínas = Contenido de nitrógeno orgánico x 6.25

En esta técnica se digieren las proteínas y otros compuestos orgánicos de los alimentos en una mezcla con ácido sulfúrico en presencia de catalizadores. El nitrógeno orgánico total se convierte en sulfato de amonio mediante la digestión. La mezcla resultante se neutraliza con una base y se destila. El destilado se recoge en una solución de ácido bórico. Los aniones de borato así formado se titulan con HCL estandarizado para determinar el nitrógeno contenido en la muestra.

En general, el método Kjeldahl tiene la ventaja de poderse ejecutar mediante equipos no muy sofisticados y puede ser realizado por técnicos poco experimentados.

RECONOCIMIENTOS

El método Kjeldahl ha sido reconocido oficialmente por un gran número de entidades oficiales y asociaciones como por ejemplo: la AOAC Internacional, EPA, AACC, AOCS, ISO, USDA y otras.

PROCEDIMIENTO

El método consta de tres etapas: DIGESTIÓN – DESTILACIÓN – TITULACIÓN.

En la DIGESTIÓN se produce la descomposición del nitrógeno que contienen las muestras orgánicas utilizando una solución de ácido concentrado. Esto se obtiene haciendo hervir la muestra en una concentración de ácido sulfúrico. El resultado es una solución de sulfato de amonio.

En la etapa de DESTILACIÓN se libera amoniaco, el cual es retenido en una solución con una cantidad conocida de ácido bórico. Inicialmente se realiza una destilación con vapor por el método de arrastre de vapor de agua, mediante la cual acelera la obtención del destilado.

Al final, se utiliza la TITULACIÓN para valorar finalmente la cantidad de amonio presente en la muestra destilada.

REACCIONES LLEVADAS A CABO EN EL MÉTODO DE KJELDAHL

DIGESTIÓN

catalizadores→
(1) n - C -NH2 + mH2SO4 → CO2 + (NH4)2 SO4 + SO2
proteína                         calor→

NEUTRALIZACIÓN Y DESTILACIÓN

(2) (NH4)2SO4 + 2 NaOH → 2NH3 + Na2SO4+ 2H2O
(3) NH3 + H3BO3 (ácido bórico) → NH4 + H2BO3- (ión borato)

TITULACIÓN

El anión borato (proporcional a la cantidad de nitrógeno) es titulado con HCl (o H2SO4) estandarizado:

(4) H2BO3- + H+ → H3BO3

EQUIPOS DE LABORATORIO

Desde hace unos años, se vienen desarrollando nuevos equipos y perfeccionado las tecnologías para ejecutar estas técnicas analíticas.

J.P. Selecta, consciente de estas necesidades de los laboratorios ha dedicado un considerable esfuerzo en poner en el mercado una renovada gama de equipos lo más completa posible con el fin de facilitar la labor de desarrollar el método Kjeldahl con la rapidez, la precisión y la reproducibilidad de resultados.

Los equipos para la determinación del nitrógeno orgánico están compuestos por tres elementos básicos:

- Unidad de digestión Bloc-Digest.
- Útiles de manipulación (Macro o Micro).
- El destilador Pro-Nitro M, “Pro-Nitro S” (semiautomático) Y “Pro-Nitro A” (automático)

Recientemente se ha incorporado el sistema automático Auto Digest 20 el cual optimiza la rapidez y la fiabilidad a los profesionales de laboratorio.

PROCESO DE DIGESTIÓN

Una serie de condiciones interrelacionadas en el proceso de digestión determinan la velocidad de la reacción y de la descomposición de nitrógeno en sulfato de amonio, como son la cantidad de calor transferida, la cantidad de sales para elevar la temperatura de ebullición del ácido, el catalizador empleado y el tiempo de la digestión. El ajuste de cualquiera de estos parámetros tiene influencia sobre el resto. Hay estudios que determinan los parámetros para obtener las condiciones óptimas dependiendo de la matriz de las muestras. Por ejemplo, la cantidad de ácido necesario varía dependiendo de la grasa que contiene la muestra. A más grasa, más ácido se requiere. También varía con el tiempo de la digestión. A mayor tiempo, más ácido perdido por evaporación.

El tiempo de digestión debe determinarse dependiendo de la cantidad de recuperación mediante la utilización de muestras de matriz conocida.

La adición de sales es útil para elevar la temperatura de ebullición del H2SO4. Dependiendo del tipo de sales empleadas, la temperatura puede pasar de ser de 330ºC estando el ácido sulfúrico sólo, a una de 400ºC, con lo que se acelera el ritmo de la descomposición y se acorta el tiempo de la digestión de forma considerable.

Para realizar la digestión, suele utilizarse un bloque calefactor construido en aluminio, rodeado de una gruesa capa de aislante térmico y montado en una estructura de acero inoxidable. Hay distintos tamaños de bloque para 6, 12 y 20 muestras. El elemento calefactor es una resistencia eléctrica de alta potencia la cual se controla desde un equipo electrónico que incorpora un microprocesador el cual permite al usuario elegir y memorizar varios programas de trabajo con rampas y tiempos totalmente programables. Dicha capacidad de programación consigue optimizar las digestiones de acuerdo con el material empleado.

LA DIGESTIÓN SE REALIZA EN TRES PASOS

  1. En función del contenido de agua de la muestra, empezar la digestión evaporando agua a 150ºC entre 15 y 30 minutos.
  2. Realizar un segundo paso entre 270 y 300ºC con una duración de entre 15 y 30 minutos con el fin de reducir la producción de humos blancos.
  3. Continuar la digestión a 400ºC entre 60 y 90 minutos.

Control Visual: El resultado es un líquido transparente nítido con coloración azul claro, verde o amarillo dependiendo del catalizador utilizado. No deben quedar restos negros adheridos a la pared de tubo.

ALGUNOS EJEMPLOS DE PROGRAMACIÓN:

Queso o carne:
Paso 1: 150ºC / 30’  Paso 2 : 270ºC / 30’  Paso 3: 400ºC / 90’

Cereales:
Paso 1: 150ºC / 15’  Paso 2 : 300ºC / 15’  Paso 3: 400ºC / 60’

LOS EQUIPOS DE J.P. SELECTA MÁS INDICADOS PARA EFECTUAR EL PROCESO DE DIGESTIÓN SON LOS SIGUIENTES: UNIDAD DE DIGESTIÓN “BLOC-DIGEST”

Características:

  • Menor manipulación de las muestras.
  • Calentamiento uniforme del bloque de aluminio.
  • Rango de temperatura de 45 a 450 ºC.
  • Memoria para 20 programas de 4 pasos.
  • Tiempo máximo por paso: 600 minutos.
  • Indicación acústica de fin de programa de digestión.
  • Dos gradientes de temperatura seleccionables: Kjeldahl / D.Q.O.
  • Alarma de rotura del sensor de temperatura.
  • Control independiente de temperatura.
  • Conexión serie RS-232 bidireccional para registro de temperaturas y edición del programa de digestión con el RAT conectado a un ordenador.

Se incluye en la unidad de digestión un CD con el Software. El software, facilita la edición de programas de digestión y permite realizar un seguimiento y registro de la temperatura del digestor.

SISTEMA DE EXTRACCIÓN Y NEUTRALIZACIÓN DE GASES

Especialmente diseñado para absorber y neutralizar los gases ácidos generados en los procesos de digestión Kjeldahl.

Está formado por una unidad “Scrubber” que bloquea el paso y neutraliza las condensaciones ácidas, y una bomba de recirculación de agua que proporciona un gran caudal de vacío para la aspiración de los gases.

Es imprescindible intercalar la unidad “Scrubber” con la solución neutralizadora entre el digestor y la bomba de recirculación.

EQUIPO AUTOMÁTICO PARA LA DIGESTIÓN AUTO DIGEST 20

El equipo efectúa el proceso de digestión de forma totalmente automática, con elevación y descenso del rack portamuestras.

Aparato con estructura metálica con soporte de muestras automático esmaltado en epoxi. Gradilla con soporte portatubos compuesta de una plancha especial en dur-al tratado químicamente.

Características:

  • Manipulación automática de las muestras.
  • Calentamiento uniforme.
  • Unidad automática de control con capacidad para 20 programas de temperatura, tiempo, elevación de muestras una vez finalizada la digestión y marcha/paro del “Scrubber”. Salida RS-232 para registro de temperatura y programación de la digestión desde ordenador.
  • Sistema colector de gases que permite ser utilizado sin cabinas extractoras.

Se suministra completo compuesto de:

  • 1 bloque metálico calefactor de 20 plazas.
  • 1 sistema de elevación automático de las muestras.
  • 1 programador “Rat-2” de procesos tiempo/temperatura.
  • 1 gradilla con soporte portatubos.
  • 1 colector de humos.
  • 20 tubos para digestión de 250 ml de capacidad.

PROCESO DE DESTILACIÓN

El producto de la digestión suele ser diluido con agua libre de amoniaco para minimizar los efectos de las mezclas que contienen altas proporciones acido/sales.

La mayor parte del NH3 es destilado y atrapado en la solución ácida durante los primeros 5 a 10 minutos de ebullición, pero dependiendo del volumen de la mezcla de la digestión y del método seguido entre 20 y 140ml de condensado puede ser recogido para obtener una completa recolección del nitrógeno. A veces se requiere alargar la destilación, lo cual produce mayor cantidad de agua pero esto no hace variar los resultados a la hora de hacer la valoración.

La velocidad de la destilación varía con la capacidad de enfriamiento del condensador y con la capacidad de generar calor del calefactor. El sistema de calentar por arrastre de vapor de agua acelera la obtención del destilado. Utilizando una solución receptora a base de ácido bórico no se necesita dosificar con precisión, ya que la titulación mide exactamente la cantidad de amoniaco neutralizando a 1:1 el complejo formado por el amoniaco y el ácido bórico. De hecho, se puede añadir bastante bórico con el fin de asegurar la completa absorción del amoníaco.

La solución receptora debe permanecer a 45ºC para evitar la pérdida de amoniaco.

LOS EQUIPOS DE J.P. SELECTA MÁS INDICADOS PARA EL PROCESO DE DESTILACIÓN SON LOS SIGUIENTES: DESTILADOR Kjeldahl “PRONITRO M” Y “PRONITRO S”

El Pronitro M es un Kjeldahl con un grado de automatización que proporciona una operación sencilla y segura. Adecuado para un laboratorio con un volumen de muestras pequeño o medio.

Características:

  • Unidad de destilación por arrastre de vapor.
  • Generador de vapor compacto con termostato de seguridad de sobretemperatura y presostato de protección contra sobrepresión.
  • Puerta de seguridad para impedir la destilación con la puerta abierta.
  • Detección de presencia del tubo de digestión/destilación. Este dispositivo impide la dosificación de NaOH si no hay tubo.
  • Adaptador universal para tubos de digestión/destilación MACRO (Ø 42 mm) y MICRO (Ø 26 mm).
  • Los depósitos de H2O y NaOH se alojan en el interior del equipo, lo que ahorra espacio en el laboratorio.
  • Bastidor de acero inoxidable y frontal de plástico ABS.
  • Kit de adaptación a valorador automático.

Especificaciones:

  • Rango de medición: de 0,2 a 200 mg de Nitrógeno Kjeldahl.
  • Tiempo de destilación programable.
  • Recuperación de Nitrógeno: > 99,5%.
  • Velocidad de destilación: de 35 a 40 ml/minuto.
  • Duración típica de una destilación: de 7 a 10 minutos.
  • Consumo de agua de refrigeración: de 80 a 100 litros/h.
  • Consumo de agua del generador de vapor: 2,5 litros/h.
  • Capacidad del depósito de agua para el generador de vapor: 6 litros.
  • Capacidad del depósito de NaOH: 2 litros.

PROCESO DE VALORACIÓN

El ácido bórico captura el gas de amoníaco y forma un complejo amoníaco-bórico. Cuando el amoníaco es capturado el color de la solución receptora cambia. Se procede de la siguiente forma:

• Valorar el destilado con HCl ó H2SO4 hasta el cambio de color. (punto final: pH 4.65)
Moles de HCl = Moles de NH3 = Moles de N en la muestra
Moles de H2SO4= 2Moles de NH3 = 2Moles de N en la muestra

De hecho, se pueden utilizar diferentes indicadores para obtener un viraje lo más limpio y pronunciado. Si se hace difícil detectar el punto de viraje, puede ser útil utilizar una solución de referencia de blanco.

CÁLCULOS

Al hacer los cálculos hay que tener en cuenta la solución receptora y los factores de dilución utilizados en proceso de destilación. Se pueden tomar referencias en los métodos de referencia publicados.

• Realizar el cálculo:

mg N = N x V x 14

Donde:

N = Normalidad del ácido de valoración
V = Volumen de ácido consumido
14 = Peso atómico del nitrógeno.

• Para pasar a contenido de proteínas corregir por el factor adecuado según la naturaleza de la muestra. (6.25 por defecto)
• Periódicamente realizar un ensayo en blanco y restarlo del resultado.

% Proteins = P2/P0 x 100 x F

Donde:

P2: Nitrógeno (mg).
P0: Peso de la muestra (mg).
F: Factor proteínico.
(6.25 por defecto)


J.P. SELECTA DISPONE DEL ANALIZADOR “PRONITRO A” EL CUAL REALIZA LA DESTILACIÓN Y LA VALORACIÓN.

DESTILADOR KJELDAHL AUTOMÁTICO “PRONITRO A”

Destilador Kjeldahl completamente automático con sistema de valoración «On-line» (Valoración en tiempo real). Para un análisis, sistemático, de gran precisión, con mínima intervención del personal, sencillo y seguro. Adecuado para un laboratorio con un volumen de muestras mediano o grande.

El destilador Kjeldahl «PRO-NITRO A» valora el destilado al mismo tiempo que éste se obtiene (Valoración «On-Line), por lo que la destilación y la valoración se convierten en una sola operación, acortando, drásticamente el tiempo por análisis realizado.

Este tipo de valoración ofrece otra ventaja adicional: detecta el punto en que la muestra ya no desprende más Nitrógeno, ésta propiedad es aprovechada para detener la destilación en el momento adecuado asegurando, así, que el tiempo de destilación es siempre el óptimo para obtener una máxima recuperación de Nitrógeno y no prolongar la destilación más tiempo del necesario.

La valoración por colorimetría es aceptada por la AOAC y no necesita ninguna calibración periódica.

Características:

  • Unidad de destilación por arrastre de vapor.
  • Con valorador automático «On-line» por colorimetría.
  • Generador de vapor compacto con termostato de seguridad de sobretemperatura y presostato de protección contra sobrepresión.
  • Puerta de seguridad que impide la destilación con la puerta abierta.
  • Detección de presencia de tubo de digestión/destilación. Este dispositivo impide la dosificación de NaOH si no hay tubo.
  • Adaptador universal para tubos de digestión/destilación MACRO (Ø 42 mm) y MICRO (Ø 26 mm).
  • Ahorro de espacio en el laboratorio: Los depósitos de H2O y NaOH, ácido Bórico y HCl se alojan en el interior del equipo.Sistema de vaciado del tubo de digestión/destilación y del colector.
  • Paro de la destilación automático.
  • Display LCD de 20 x 4 caracteres de gran tamaño.
  • Salida RS-232 para imprimir los resultados.
  • Bastidor de acero inoxidable y frontal de plástico ABS.

Especificaciones:

  • Rango de medición: de 0.2 a 200 mg Nitrógeno.
  • Recuperación de Nitrógeno: > 99,5%.
  • Velocidad de destilación: de 35 a 40 ml/minuto.
  • Consumo de agua de refrigeración: de 80 a 100 litros/h.
  • Consumo de agua del generador de vapor: 2,5 litros/h.
  • Capacidad del depósito de agua para el generador de vapor: 6 litros.
  • Capacidad del depósito de NaOH: 2 litros.
  • Capacidad del depósito de ácido Bórico: 2 litros.
  • Capacidad del depósito de reactivo de valoración: 2 litros.
  • Precisión del valorador: 1,5%.
  • Dosis mínima del valorador: 0,01 ml.

EJEMPLO PRÁCTICO

DETERMINACIÓN DE LA PROTEÍNA BRUTA POR EL MÉTODO DE KJELDAHL.

1. Principio:

El método consiste en mineralizar la muestra con ácido sulfúrico concentrado y alcalinizar con hidróxido de sodio. El amoníaco liberado es arrastrado por destilación y recogido sobre ácido bórico. La posterior valoración con ácido clorhídrico permite el cálculo de la cantidad inicialmente presente de proteína en la muestra.

2. Reactivos necesarios:

  • Ácido sulfúrico 96% (d=1.84).
  • NaOH, solución 35% (p/v).
  • Indicador mixto, especial para titulaciones de amoníaco.
  • Catalizador Kjeldahl.
  • Acido bórico al 4% (p/v).
  • HCl 0.25N.
  • Agua destilada.
  • Piedra pómez en granos.

Nota: Es muy importante que todos los reactivos estén totalmente exentos de nitrógeno.

3. Material necesario:

  • Balanza de resolución 0.1 mg.
  • Unidad digestora (Bloc-Digest).
  • Programador de proceso RAT.
  • Colector / Extractor de humos.
  • Destilador Pro-Nitro M o Pro-Nitro A.
  • Bureta para valoración.

4. Digestión:

  • Pesar alrededor de 1 gramo de muestra perfectamente molida y homogeneizada en un papel exento de nitrógeno e introducirlo en un tubo de digestión.
  • Añadir al tubo con muestra 10 g de catalizador Kjeldahl, 25 ml de ácido sulfúrico al 96% (d=1.84), y algunos gránulos de piedra pómez tratada.
  • Colocar los tubos de digestión con la muestras en el Bloc-Digest con el colector de humos funcionando.
  • Realizar la digestión a una temperatura entre 350..420ºC y un tiempo que puede variar entre 1 y 2h.
  • Al finalizar, el líquido obtenido es de un color verde o azul transparente dependiendo del catalizador utilizado.
  • Dejar enfriar la muestra a temperatura ambiente.
  • Evitar la precipitación agitando de vez en cuando.
  • Dosificar lentamente 50 ml de agua destilada en cada tubo muestra. (Tener precaución con la violencia de la reacción).
  • Dejar enfriar la muestra a temperatura ambiente.
  • Si se produce precipitación agitar o calentar ligeramente.

5. Destilación:

Dosificar 50 ml de ácido Bórico en un matraz Erlenmeyer, y algunas gotas de indicador mixto. Colocar el Erlenmeyer en la alargadera del refrigerante teniendo la precaución de que ésta quede sumergida dentro del ácido Bórico.

Una vez colocados el tubo de muestra y el Erlenmeyer con el ácido Bórico, dosificar unos 50ml de NaOH e iniciar la destilación

La destilación debe prolongarse el suficiente tiempo para que se destilen un mínimo de 150 ml, aproximadamente de 5 a 10 minutos.

6. Ensayo en blanco:

Después de la destilación de una muestra realizar un ensayo en blanco, aplicando el método descrito, pero utilizando 5 ml de agua destilada.

7. Valoración:

Valorar con ácido clorhídrico 0.25N el destilado obtenido, hasta que la solución vire de verde a violeta.

Calcular la cantidad de nitrógeno detectado.

% Nitrogen = 1.4 x (V1-V0) x N / P

% Proteína = % Nitrógeno x F

Siendo:

P = Peso en g de la muestra.
V1 = Volumen de HCl consumido en la valoración. (ml)
N = Normalidad del HCl
V0 = Volumen de HCl consumido en la valoración del blanco. (ml)
F = Factor de conversión para pasar de contenido en nitrógeno a contenido en proteínas. Para la proteína bruta acostumbra a usarse un valor de 6.25. Para mayor exactitud, distinguiendo la calidad de la proteína según la naturaleza de la muestra, pueden emplearse otros factores de conversión.

10oct/12

Aspectos relevantes de la tecnología Peltier aplicada a las estufas incubadoras refrigeradas Selecta / Relevant aspects of Peltier technology applied to Selecta refrigerated incubators

Desde el primer día de su actividad J.P. Selecta ha procurado estar al corriente de las últimas tecnologías y metodologías aplicadas en el campo de los equipos para laboratorio. Siguiendo con este afán innovador, tan pronto se tuvo noticia de los nuevos elementos electrónicos para producir a la vez frío y calor mediante el principio denominado Peltier, se iniciaron una serie de trabajos de investigación encaminados a crear una nueva incubadora refrigerada basada en este sistema.

Los primeros trabajos con elementos Peltier destinados a conocer la tecnología ya se iniciaron a principios de la década de los 80 y no fue hasta 1990 cuando ya finalmente salió al mercado la primera estufa de incubación, novedad a nivel mundial, funcionando solamente mediante elementos Peltier.

A lo largo de estos 32 años en que tenemos nuestras incubadoras refrigeradas con el sistema Peltier en el mercado, se ha demostrado su gran eficacia y utilidad siendo esta la línea de estufas de mayor prestigio de nuestra marca.

En particular cabe destacar una larga lista de ventajas si las comparamos con las tradicionales fabricadas con elementos calefactores y grupos de frío convencionales:

Con la tecnología Peltier se realizan los procesos de calentamiento y enfriamiento en un solo y compacto sistema. Tanto el excelente nivel de ajuste como la oscilación reducida hasta lo mínimo de la temperatura obtenida se producen gracias al perfecto desarrollo de la técnica de refrigeración y calentamiento, con un ahorro energético considerable y respetuosas con el medio ambiente.

Aplicaciones:

Biotecnología, Bacteriología, Fracciones de plasma, Biología, Test encimático, Investigación, Estudios de sérum, Metrología, Botánica, Fitofarmacia, Cosmética, Análisis de aguas, Industria, Agricultura.

Prestaciones:

PRESTACIONES
ESPECIFICACIÓN
a 5ºC a 37ºC a 60ºC
Estabilidad ±0,05 °C ±0,05 °C ±0,05 °C
Homogeneidad ±0,35 ±0,30 ±0,75 °C
Error de consigna ±0,25 °C ±0,20 °C ±0,40 °C

Modelos
Aspectos más importantes:

  • Reducción del consumo energético de hasta el 90%, trabajando a temperatura ambiente de 22ºC.
  • No se produce intercambio de aire con el ambiente. El sistema de refrigeración trabaja cerrado.
  • Sistema de refrigeración hermético.
  • Óptima distribución de la temperatura.
  • Silenciosa.
  • Estable.
  • Exenta de vibraciones.
  • Exenta de condensaciones.
  • Gran precisión.
  • Puerta interior de cristal templado.
  • Antecedentes del Sistema Peltier.

El descubrimiento de los fenómenos termoeléctricos hace dos siglos, y la búsqueda de nuevas alternativas de generación de energía, ha permitido un avance continuo en la tecnología termoeléctrica en los últimos años. Desde 1834 es conocido como efecto Peltier; no obstante, su aplicación práctica necesitó del desarrollo de los materiales semiconductores. El efecto Peltier se caracteriza por la aparición de una diferencia de temperaturas entre las dos caras de un semiconductor cuando por él circula una corriente. Por lo general dicha celdas están fabricadas con Bismuto para la cara del semiconductor tipo P y Telurio para la cara tipo N.

Teoría de Funcionamiento

El establecimiento de un flujo de calor, opuesto a la difusión térmica, cuando un material sometido a un gradiente de temperatura es atravesado por una corriente eléctrica, permite pensar en aplicaciones de refrigeración termoeléctrica. Esta solución alternativa a la refrigeración clásica que utiliza ciclos de compresión-expansión no necesita de partes móviles, lo que incrementa su fiabilidad. Además de ser totalmente silenciosas, tienen un tamaño y un peso muy reducido, soportan sin problemas golpes y vibraciones, se pueden utilizar en cualquier posición, vertical, horizontal, inclinadas y, además, gracias a ellas, se puede regular la potencia frigorífica variando simplemente la corriente de alimentación.

Lo que las hace aún más interesantes es el hecho de que, al invertir la polaridad de alimentación, se invierta también su funcionamiento; es decir: la superficie que antes generaba frío empieza a generar calor y la que generaba calor, empieza a generar frío. Estas propiedades son fundamentales en aplicaciones en las que la temperatura debe ser regulada de forma muy precisa y fiable, como por ejemplo en los contenedores empleados en el transporte de órganos para trasplantes o en aquellas en las que las vibraciones son un inconveniente grave, como por ejemplo: los sistemas de guía que emplean láser, o los circuitos integrados. Además, la posibilidad de crear un flujo térmico a partir de una corriente eléctrica de manera directa hace inútil el empleo de gases como el freón, que resultan perjudiciales para la capa de ozono.

Además, la gran fiabilidad y durabilidad de estos sistemas (gracias a la ausencia de partes móviles) ha motivado su empleo en la alimentación eléctrica de sondas espaciales, como ocurre en la sonda espacial Voyager, lanzada al espacio en 1977. En ella el flujo de calor establecido entre el material fisible PuO2 (el PuO2 es radiactivo y se desintegra, constituyendo entonces una fuente de calor) y el exterior atraviesa un sistema de conversión termoeléctrica a base de SiGe (un termopar de silicio y germanio), permitiendo de esta manera la alimentación eléctrica de la sonda (las sondas espaciales no pueden alimentarse mediante paneles solares más allá de Marte, ya que el flujo solar es demasiado débil).

Como se verá a continuación, los sistemas de conversión que utilizan el efecto termoeléctrico tienen un rendimiento muy pequeño. De momento sus aplicaciones están limitadas a sectores comerciales en los que la fiabilidad y la durabilidad son más importantes que el precio.

Algunos Usos Típicos del Enfriamiento y Calentamiento Termoeléctrico

EQUIPOS DE LABORATORIO Y CIENTÍFICOS

Electrónica, diodos láser, placas de control de temperatura, cámaras de proceso y climáticas, baños de referencia de punto de congelación, baños de temperatura constante, higrómetros de punto de rocío, osmómetros, etapas del microscopio.

TECNOLOGÍA DEL TRANSPORTE

Cajas móviles, cabinas o contenedores para distribución de comida, equipos médicos, farmacéuticos, por tierra, mar o aire.

MÉDICO

Almacenamiento móvil o estacionario de sangre o farmacéuticas, instrumentos, mantas de hipotermia, enfriadores, congeladores de córnea oftálmica, analizadores de sangre, preparación y almacenaje de tejidos.

MILITAR Y AEROESPACIAL

Cajas portátiles de temperatura constante para distribución de sangre y suministros farmacéuticos, dispositivos electrónicos, sistemas de orientación inerciales de enfriamiento y calentamiento, amplificadores paramétricos y otros equipos en barcos, submarinos, camiones, aviones y naves espaciales.

AÑADIR PÁGINA DEL CATÁLOGO U OTRA INFORMACIÓN DE NUESTRA GAMA DE MODELOS.

Ricard Cardus
Departamento I+D

29sep/11

ENSAYO DE VINOS / WINE TESTS

CRIOTERMOSTATO CON AGITADOR PARA ENSAYO DE VINOS

Medida de la estabilidad tartárica de los vinos por el test de Boulton


J.P SELECTA, HA DISEÑADO UN CRIOTERMOSTATO CON SISTEMA DE REFRIGERACIÓN EN SECO QUE POR EFECTO PELTIER. NO NECESITA AGUA,  LLEVA INCORPORADO UN AGITADOR PARA ASÍ MANTENER LA MUESTRA A ENSAYAR A TEMPERATURA ESTABLE.

TEST DE BOULTON

Medida de la estabilidad tartárica de los vinos: Es un ensayo analítico que consiste en una precipitación rápida de los cristales de tartrato,ácido de potasio, que se hallan sobresaturados en el vino.

La muestra del vino objeto del análisis se enfría a 0 ºC. y se provoca una precipitación rápida de los cristales por adición de 10 g/l aproximados de un reactivo de tartrato ácido de potasio en polvo.

Se sigue la disminución del potasio por un método conductométrico. Cuando la sobresaturación se reduce a cero, ya no hay más precipitación y el valor de la conductividad permanece constante. La muestra tiene en estos momentos las características de un vino estable, y esta conductividad es la que debe tenerse en cuenta. La medida de la conductividad es muy fácil de realizar.

TÉCNICA OPERATIVA

  1. En el vaso de precipitados se vierten 100 ml de la muestra de vino, medidos con la probeta.
  2. Se coloca la varilla agitadora y se sitúa en el baño sobre el agitador.
  3. Se introduce en el vaso la célula de conductividad y el termómetro, si es necesario, y se inicia la agitación.
  4. Si el conductímetro no incorpora compensador de temperatura, observar la temperatura para que esté estabilizada a 0ºC.
  5. A continuación se añade un gramo de tartrato ácido de potasio y se lee la conductividad cada 2 minutos.
  6. Continuar las lecturas, hasta comprobar que por dos o tres veces consecutivas, la conductividad es la misma.

OBSERVACIONES

A) El valor de la conductividad final, será la que corresponde a este vino estabilizado. Este valor se comparará con la muestra del tratamiento de frío , para determinar el momento en que se obtiene la estabilidad.
B) La diferencia entre la conductividad antes de la adición del bitartrato y la final, proporciona una medida de la estabilidad potencial respecto al bitartrato. En general, si esta diferencia es inferior al 5% del valor inicial, el vino es estable; si es superior al 5% el vino es inestable.

Información suministrada por: Departamento de enología. Sra Valvanera Martínez de Toda Vallilengua – Dirección Técnica de BODEGAS COSTERS DEL SIO - LLEIDA.
Distribuidor: SOLTEVI, S.L - Vilafranca del Penedes.

21jun/11

DETERMINACION DE PROTEINAS POR EL METODO DE KJELDAHL / KJELDAHL METHOD FOR PROTEIN DETERMINATION

Francisco Santiago. Engineering Department.

INTRODUCCIÓN

El contenido total de proteínas en los alimentos está conformado por una mezcla compleja de proteínas. Estas existen en una combinación con carbohidratos o lípidos, que puede ser física o química. Actualmente todos los métodos para determinar el contenido protéico total de los alimentos son de naturaleza empírica. Un método absoluto es el aislamiento y pesado directo de la proteína pero dicho método se utiliza  sólo a veces en investigaciones bioquímicas debido a que es dificultoso y poco práctico

En 1883 el investigador danés Johann Kjeldahl desarrolló el método más usado en la actualidad para el análisis de proteínas (método Kjeldahl) mediante la determinación del nitrógeno orgánico. En esta técnica se digieren las proteínas y otros componentes orgánicos de los alimentos en una mezcla con ácido sulfúrico en presencia de catalizadores.  El nitrógeno orgánico total se convierte mediante esta digestión en sulfato de amonio.  La mezcla digerida se neutraliza con una base y se destila posteriormente. El destilado se recoge en una solución de ácido bórico.  Los aniones del borato así formado se titulan con HCl (o H2SO4) estandarizado para determinar  el nitrógeno contenido en la muestra.

El resultado del análisis es una buena aproximación del contenido de proteína cruda del alimento ya que el nitrógeno también proviene de componentes no proteicos.

El método Kjeldahl ha sufrido varias modificaciones. Originalmente se utilizó permanganato de potasio para llevar a cabo el proceso de oxidación (digestión), sin embargo, los resultados no fueron satisfactorios, de manera que este reactivo se descartó.  En 1885 Wilforth encontró que se podía acelerar la digestión utilizando ácido sulfúrico y añadiendo un catalizador.  Gunning en 1889 propuso añadir  sulfato de potasio que eleva el punto de ebullición del ácido sulfúrico utilizado en la digestión para disminuir el tiempo de la reacción.

En  la actualidad se utiliza principalmente Sulfato de Cobre penta hidratrado CuSO4.5H2O como catalizador.

REACCIONES LLEVADAS A CABO EN EL MÉTODO DE KJELDAHL

DIGESTIÓN

catalizadores→
(1) n - C -NH2 + mH2SO4 CO2 + (NH4)2 SO4 + SO2
proteína                                calor→

NEUTRALIZACIÓN Y DESTILACIÓN

(2) (NH2)SO4 + 2 NaOH          →          2NH3 + Na2SO4+ 2H2O
(3) NH3 + H3BO3 (ácido bórico)         →          NH4 + H2BO3- (ión borato)

TITULACIÓN

El anión borato (proporcional a la cantidad de nitrógeno) es titulado con HCl (o H2SO4) estandarizado:

(4) H2BO3- + H+             → H3BO3

MATERIAL
J.P SELECTA suministra los equipos necesarios para la realización del procedimiento por el método Kjeldahl.

-1 bureta electrónica “Digitrate-Pro 50”  resolución 0.01 ml.
Código 0182026

-1 balanza analítica de precisión “FA-2204B” resolución 0,1mg.
Código
5830039

-1 Unidad de digestión (Bloc Digest) para 6, 12 y 20 plazas.
Códigos
4000629, 4000630, 4000631

-1 Unidad Scrubber.
Código
4001611

-1 Bomba de circulación de agua.
Código 4001612

-1 Aparato destilador Kjeldahl (Pro Nitro M, S o A).
Códigos 4002627, 4002851, 4002430

- Material diverso de laboratorio

REACTIVOS

Reactivos preparados:

Es aconsejable la utilización de reactivos ya preparados, especialmente el HCl (o H2SO4) de valoración. Cualquier error en su preparación puede afectar directamente al resultado de la determinación.

Utilizar los siguientes, o sus equivalentes en otras marcas:

•      Ácido Bórico (en polvo) 99.5%     PANREAC 141015
•      Indicador  mixto 4.8 (ó 5) RV   PANREAC 283303

(Rojo metilo + Verde de Bromocresol)

•      Indicador mixto  4.4 RV   PANREAC 282430

(Rojo metilo + Azul de Metileno)

•      HCl 0.1N SV   PANREAC 171023
•      HCl 0.25N SV   PANREAC 182318
•      H2SO4 0.1N SV   PANREAC 181061
•      H2SO4 0.2N SV   PANREAC 182011
•      Sodio Hidróxido 40% RE   PANREAC 171220

(Para determinación de N)

•      Acetanilida 99% (Patrón para validación)   PANREAC 151005
•      Amonio sulfato (Patrón para validación)   PANREAC 131140
•      Catalizador Kjeldahl 6.25% Cu tabl. 8g   PANREAC 174428

Preparación de la solución fijadora de amoníaco

1.- Con indicador Mixto 4.8 (ó 5)

Preparar la solución de la siguiente fórmula para 1 litro de solución fijadora:

•      Pesar 10g de Acido Bórico (en polvo)   PANREAC 141015
•      Disolverlo en 1 litro de agua destilada.
•      Añadir 15ml de Indicador mixto 5.   PANREAC 283303

2.- Con indicador mixto 4.4

Preparar la solución de la siguiente fórmula para 1 litro de solución fijadora:

•      Pesar 10g de Ácido Bórico (en polvo)   PANREAC 141015
•      Disolverlo en 1 litro de agua destilada.
•      Añadir 10ml de Indicador mixto 4.4.   PANREAC 282430

PROCEDIMIENTO

REPARACIÓN DE LA MUESTRA
  1. Triturar, homogeneizar y mezclar la muestra.
  2. Pesar entre 1 y 2 gramos de muestra.
  3. En muestras con contenidos de nitrógeno muy pequeño, tomar la muestra suficiente para que contenga como mínimo 5 mg de nitrógeno.
DIGESTIÓN

•   Añadir entre 10 y 15 ml (tubo macro) de H2SO4 96-98% y 1 tableta (8 gm) de catalizador.
(Para el tubo micro, el máximo de H2SO4  es 5ml)
•   Montar un sistema para la extracción de humos o scrubber con Na2CO3.
•   Realizar la digestión en tres pasos:

1. En función del contenido de agua de la muestra, empezar la digestión evaporando agua a 150ºC entre 15 y 30 minutos.
2.
Realizar un segundo paso entre 270 y 300ºC entre 15 o 30 minutos para reducir la producción de humos blancos.
3.
Continuar la digestión a 400ºC entre  60  y 90 minutos.

Algunos ejemplos:

Queso o carne:
Paso1º: 150ºC / 30’            Paso 2 : 270ºC / 30’            Paso 3: 400ºC / 90’

Cereales:
Paso1º: 150ºC / 15’            Paso 2 : 300ºC / 15’            Paso 3: 400ºC / 60’

Control Visual: El resultado es un líquido transparente nítido con coloración azul claro, verde o amarillo dependiendo del catalizador utilizado. No deben quedar restos negros adheridos a la pared de tubo.

Nota: Durante la digestión debe controlarse la producción de espuma en las muestras. Si esta es excesiva, debe alargarse el paso nº 1.

DILUCIÓN

•   Sacar los tubos muestra del bloque digestor y dejar enfriar a Tª ambiente. (Puede forzarse     sumergiendo los tubos, cautelosamente, en un poco de agua).
•   Añadir unos 25ml de agua destilada en cada tubo.
•   Añadir el agua despacio y moviendo el tubo sin dejar solidificar la muestra. Si es necesario     calentar ligeramente el tubo (por ej. introduciéndolo en el bloque digestor todavía caliente)
•   Dejar enfriar de nuevo hasta Tª ambiente.
•   Para evitar pérdidas de nitrógeno y reacciones violentas no introducir el tubo todavía caliente     al destilador.

DESTILACIÓN

•   Situar un Erlenmeyer de 250ml a la salida del refrigerante con 50ml de ácido Bórico y unas     gotas de indicador.
•   Programar una dosificación de 50 a 75 ml de NaOH.
•   Introducir el tubo con la muestra en el destilador.
•   Destilar hasta recoger 250ml en el Erlenmeyer (50ml Bórico + 200ml de destilado).

Control Visual: Una vez se ha añadido el NaOH, la muestra debe tomar una coloración azulada, de no ser así, añadir más NaOH.

VALORACIÓN Y CÁLCULO

•   Valorar el destilado con HCl ó H2SO4  hasta el cambio de color. (punto final: pH 4.65)
Moles de HCl = Moles de NH3 = Moles de N en la muestra
Moles de H2SO4= 2Moles de NH3 = 2Moles de N en la muestra
•   Realizar el cálculo:

mg N = N x  V   x  14

Donde:

N = Normalidad del ácido de valoración
V = Volumen de ácido consumido
14 = Peso atómico del nitrógeno.

•   Para pasar a contenido de proteínas corregir por el factor adecuado según la naturaleza de la     muestra. (6.25 por defecto)
•   Periódicamente realizar un ensayo en blanco y restarlo del resultado.

% Proteínas =   P2/P0 x 100 x F

Donde:

P2: Nitrógeno (mg).
P0: Peso de la muestra (mg).
F: Factor proteínico.
(6.25 por defecto)

Factor protéico de algunos alimentos:

Almendras  5,18
Nueces 5,30
Nueces - cacahuetes  5,41
Gelatina 5,55
Soja 5,71
Cebada, avena, centeno 5.83
Trigo, harina entera 5,83
Harinas (no entera) 5,70
Arroz  5,95
Maíz  6,25
Todos los otros alimentos 6,25
Salvado 6,31
Leche y lácteos 6,38

VERIFICACIÓN DE LA RECUPERACIÓN CON AMONIO SULFATO

Esta verificación es ampliamente utilizada para certificar el funcionamiento del destilador.

Se trata de preparar una muestra cuyo contenido de nitrógeno es conocido. Esta se destila, se valora con HCl 0.25N y se calcula el Nitrógeno detectado.

El porcentaje de nitrógeno detectado sobre el de la muestra se denomina recuperación de Nitrógeno.

Preparar la muestra:

Contenido de nitrógeno de una muestra de Amonio sulfato :

Formula: (NH4)2 SO4
Peso molecular: 132.14ç
Factor: 14 * 2 / 132.14 = 0.212
mg de Nitrógeno = 0.212 * mg de Amonio sulfato

•   Pesar unos 100mg  de amonio sulfato. El peso exacto será P0
•   La cantidad exacta de Nitrógeno es:

P1  (mg) = P0   x 0,212

•   Destilar añadiendo 25ml de NaOH
•   Una vez destilado y valorado obtenemos el nitrógeno (mg) detectado: P2

P2 =  N  x  V   x  14

Donde:

N  = Normalidad del ácido de valoración (HCl  0.25)
V  = Volumen de ácido consumido
14 = Peso atómico del nitrógeno.

•   Calculamos la recuperación:

R(%) = P2 / P1 *100

•   La recuperación aceptable es entre 99.5 y 100.5 %.

Si se utiliza HCl de normalidad diferente preparar muestras:

NormalidadMuestra de Amonio sulfato.

0,05                               20 ...  40 mg

0,1                                 40 ...  90 mg

0,25                               100  …  200 mg

0,5                                 200  …  400  mg

VERIFICACIÓN DE LA RECUPERACION CON ACETANILIDA

Esta verificación es ampliamente utilizada para certificar el funcionamiento del proceso completo del análisis del nitrógeno Kjeldahl que incluye las etapas de digestión, destilación y valoración.

Se trata de preparar una muestra cuyo contenido de nitrógeno es conocido. Esta se digiere, se destila, se valora y se calcula el Nitrógeno detectado.

El porcentaje de nitrógeno detectado sobre el de la muestra se denomina recuperación de Nitrógeno.

Para realizar ésta verificación se utiliza la Acetanilida.

Preparar la muestra:

Contenido de nitrógeno de una muestra de Acetanilida :

Fórmula: C8H9NO
Peso molecular: 135.17
Factor: 14 / 135.17 = 0.1035
mg de Nitrógeno = 0.1035 * mg de Acetanilida

•   Pesar alrededor de 250mg  de acetanilida. El peso exacto será P0
•   La cantidad exacta de Nitrógeno es:

P1  (mg) = P0   x  0,1035

Digestión de la muestra:

•   Colocar la acetanilida en un tubo, añadir 10ml de ácido sulfúrico 98%  y una tableta de     catalizador Kjeldahl.
•   Digerir a 400ºC durante 1h. (El resultado debe ser un líquido transparente con coloración     azul.)
•   Dejar enfriar y añadir 25ml de agua destilada en cada tubo. Tomar precauciones para evitar     salpicaduras. La reacción del agua sobre el ácido sulfúrico es violenta.

Destilar:

•   Destilar añadiendo 75ml de NaOH. Utilizar HCI 0.25N  para la valoración.
•   Una vez destilado y valorado, obtenemos el nitrógeno (mg) detectado: P2

Donde:

N  = Normalidad del ácido de valoración (HCl  0.25).
V  = Volumen de ácido consumido.
14 = Peso atómico del nitrógeno.
P2 = N  x  V   x  14

•   Calculamos la recuperación:

R(%) = P2 / P1 *100

•   La recuperación aceptable es entre 99.5 y 100.5 %.

FUENTES DE ERROR

Las principales fuentes de error son:

En el proceso de digestión:

1.- La inclusión de nitrógeno no protéico (aunque la cantidad de este nitrógeno suele ser despreciable comparada con la del nitrógeno protéico);
2.- La pérdida de nitrógeno durante la digestión. El exceso de sulfato de sodio o potasio  que se añade al ácido para elevar el punto de ebullición, puede producir una descomposición por calor y por lo tanto pérdida de nitrógeno. Por otro lado, el exceso de catalizador (de cobre generalmente) también puede producir pérdidas de nitrógeno
3.- La digestión incompleta de la muestra. Generalmente debida a falta de tiempo de reacción o falta de ácido sulfúrico.

Durante la destilación:

1.- Neutralización incompleta de la mezcla digerida. Es necesario añadir suficiente NaOH para neutralizar el exceso de ácido sulfúrico resultante de la digestión así como transformar todo el amonio formado en la digestión en amoníaco.
2.- Perdida de amoníaco por fugas en el circuito de destilación.
3.- Perdida de amoniaco por refrigeración insuficiente en el condensador.

BIBLIOGRAFÍA

A.O.A.C. 1980. Association of Official Agricultural Chemists.  Official Methods of Analysis. Washington, D.C.
Nielsen, S.S. 1994. Introduction to the Chemical Analysis of Foods. Ed. Jones and Bartlett Publishers. U.S.A. pp 209-212.
Ranganna, S. 1977. Manual of Analysis of Fruit and Vegetable Products.  Ed. McGraw-Hill Publishing Co. Ltd. New Delhi.
Yeshajahu P. y Meloan C.E. 1987. Food Analysis. Theory and Practice. 2ª. Ed. AVI U.S.A. pp 753-758.

29abr/11

INCUBATOR CO2

INCUBADORA PARA CULTIVO ANAEROBIO DE CÉLULAS Y TEJIDOS "INCUBATOR CO2"

Las incubadoras de CO2 son uno de los elementos básicos para laboratorios de investigación que trabajen en el área de biología celular.

Tanto en trabajos de ciencias biológicas tradicionales para el cultivo anaerobio de células y tejidos, en biología molecular como en los campos emergentes y de rápido crecimiento como son los de las células madres, la fertilización in vitro, los nuevos productos farmacéuticos, en oncología, etc, las incubadoras de CO2 son una gran herramienta de trabajo que permite facilitar y acelerar la obtención de resultados.

Para satisfacer las necesidades más exigentes de cualquier laboratorio avanzado, J.P. Selecta fabrica las incubadoras INCUBATOR CO2, las cuales cumplen con los requerimientos del segmento medio-alto del mercado, tanto por su fiabilidad y durabilidad como por su precisión y facilidad de programación.

La incubadora INCUBATOR CO2 cumple con la norma DIN 12880 Clase 3.1 de seguridad incluyendo un segundo controlador independiente de sobre temperatura, indicador de desvío de consigna de CO2, indicación de puerta abierta, de falta de presión de CO2 y de falta de energía eléctrica.

También incorpora las últimas tecnologías como la monitorización de CO2 mediante sensor de infrarrojos, control total por microprocesador, programación y manejo por un único monomando en concordancia con una amplia pantalla alfanumérica interactiva con el usuario.

Puede controlarse externamente a través de un ordenador, permite también grabar los procesos en un “pen-drive” mediante acoplarle el accesorio especial de conexión USB como también imprimirlos con la impresora que se le puede instalar opcionalmente.

Incluye esterilización de la cámara, y dispone de doble puerta, una interior de cristal reforzado y con junta de silicona, y la exterior con sistema de calefacción para evitar condensaciones sobre la de vidrio. El grado de humedad se mantiene constante, del orden del 98% producido por la evaporación del agua de la cubeta interior.

Además, dispone de un completísimo sistema de ALARMAS. Estas están tipificadas de la siguiente manera:

  • Puerta abierta durante más de 20 segundos.
  • La temperatura de la cámara de incubación supera la temperatura de  alarma prefijada por el usuario durante más de 7 minutos.
  • La presión del suministro de CO2 baja durante más de 20 segundos.
  • El valor de la concentración de CO2 medida supera el máximo prefijado  por el usuario. Cierre la válvula de CO2.
  • La temperatura de la cámara inferior se encuentra al valor mínimo pro gramado.
  • El valor de la concentración de CO2 medida es inferior al mínimo prefijado por el usuario.
  • La válvula de CO2 abierta durante más de 7 minutos ininterrumpidamente.
  • Diferencia entre las dos sondas superior a 2ºC durante más de 5 minutos.

Características Técnicas:

- Cuerpo de acero esmaltado al horno en epoxi.
- Aislamiento térmico alrededor de la cámara útil.
- Cámara interior de acero inoxidable.
- Puerta interior de vidrio templado con junta de silicona.
- Puerta exterior en acero con cierre magnético y calefacción.
- Toma de CO2 en la parte posterior para tubo de Ø 6 y 4 mm con micro filtro.
- Toma de muestra frontal para analizar la concentración de CO2.
- Conexión RS232
- Grado de humedad controlada al 98% H.R.
- Control y programación por monomando.
- Pantalla LCD alfanumérica de 2x40.
- Control digital por microprocesador de la temperatura y del CO2.
- Rango de temperatura desde ambiente +5ºC a 50ºC.
- Estabilidad ±0.2ºC a 37ºC.
- Homogeneidad ±0.5ºC a 37ºC.
- Resolución: 0.1ºC
- Rango de alarma: desde ambiente +5ºC hasta 50ºC.
- Rango de CO2 del 0 al 20%.
- Estabilidad del CO2: ±0.3%
- Resolución del CO2: 0.1%
- Capacidad 150L. con 9 guías para bandejas.
- Medidas exteriores: 95cm alto x 65cm ancho x 73cm fondo.
- Medidas interiores:65cm alto x 50cm ancho x 46cm fondo.
- Peso: 110 Kg.
- Consumo eléctrico: 800 W.

Departamento de ingenieria de J.P Selecta.

10dic/10

AUTOCLAVES DE LABORATORIO / LABORATORY AUTOCLAVES

ESTERILIZACIÓN

La esterilización es el proceso mediante el cual se alcanza la destrucción o eliminación de todas las formas de vida microbianas, incluyendo las bacterias y sus estructuras.

Los Autoclaves para laboratorio permiten efectuar una esterilización utilizando vapor de agua a una presión mayor que la atmosférica, acumulando así la temperatura de vapor alcanzando desde los 105ºC hasta 134ºC, según los microorganismos que se pretendan destruir. El vapor penetra en la cámara de esterilización a la presión programada; Al condensarse, libera calor húmedo calentando el material introducido en la misma, de forma simultanea.

J.P. SELECTA, ofrece una extensa gama de Autoclaves, de laboratorio, de sobremesa, para odontologia y medicina, pudiendo elegir desde modelos de purgado manual, atmosférico o por vacío, de los que, destacamos las siguientes Autoclaves para laboratorio:

"PRESOCLAVE II" para capacidades de 50 y 80 litros, con regulación electrónica de temperatura, tiempo y purgado atmosférico.

"AUTESTER ST DRY PV II" para capacidades de 50, 80 y 150 litros, con control de procesos por microprocesador, sistema de secado y purgado automático por vacío fraccionado.

Dispone de salida RS232 para impresión de parámetros por ordenador, módulo USB para memorización de parámetros e impresora térmica con indicación de temperatura, presión, tiempo y modalidad.

A modo de información, relacionamos cuadro de los distintos programas para los diferentes materiales a esterilizar :

Las Autoclaves J.P. Selecta, cumplen con el Certificado del Sistema de Gestión de la Calidad UNE-EN ISO 9001, AENOR entidad acreditada por ENAC con el nº 01/C-SC003 y las Normas de Seguridad : EN 61010-1 , EN 61010-2-040 y EN 61326.

9dic/10

VALIDACION DEL PROCEDIMIENTO DE ANALISIS DE N-KJELDAHL EN AGUAS RESIDUALES / N-KJELDAHL ANALYSIS PROCEDURE VALIDATION IN WASTEWATER

M. Monras, licenciado en ciencias químicas (Institut Quimic de Sarrià).
Lourdes Margarit, ingeniera química. (IQS); Departamento de química analítica.
Mª José Blanco, Gestión de la calidad (IQS).
David Pecanins, Ingeniero del departamento de Calidad de J.P. SELECTA, s.a.

0. SUMARIO

En este trabajo se ha validado el procedimiento de análisis de N-Kjeldahl en aguas residuales en un rango de concentraciones comprendido entre 20 y 1000 mg N/L, incluyendo el cálculo de la incertidumbre asociada al análisis.

Todos los análisis se han llevado a cabo con la unidad de digestión “Bloc-digest” JP Selecta y con el “Destilador automático PRONITRO “A”” JP Selecta.

1. INTRODUCCIÓN.

La determinación del contenido en nitrógeno de una muestra es de gran interés en el ámbito alimentario y medioambiental. En 1883, el químico danés Johan Kjeldahl (1849-1900) presentó por primera vez en la “Danish Chemical Society” un método para la determinación de lo que se conoce como “nitrógeno Kjeldahl”, que proporciona el contenido de nitrógeno orgánico más nitrógeno amoniacal de una muestra. (1)

A partir de esta fecha, el método Kjeldahl ha sido objeto de estudio continuo en el campo de la química analítica y se ha optimizado en las tres etapas en que se fundamenta: (2)

1. Digestión de la muestra en medio ácido: en esta etapa tiene lugar la conversión de la mayoría del nitrógeno orgánico y amoniacal en ion amónio. La eficiencia del proceso de la digestión ha ido mejorando a lo largo de los años con la adición de sales inorgánicas para aumentar el punto de ebullición del ácido sulfúrico, la utilización de bloques digestores (introducida en 1970 por el químico sueco Roger Moosberg), la optimización del tiempo y temperatura de digestión y el uso de diferentes sustancias como catalizadores.

2. Basificación y destilación de la muestra: en esta etapa se libera amoníaco, el cual es retenido en una disolución con una cantidad conocida de ácido o en una disolución de ácido bórico. Inicialmente se realizaba una destilación simple con un baño de vapor, aunque actualmente ha sido ya sustituida por una destilación por arrastre de vapor de agua, la cual permite disminuir considerablemente el tiempo de análisis.

3. Valoración ácido-base: ésta puede ser una valoración por retroceso, si el amoníaco liberado ha sido recogido sobre una solución ácida, o una valoración directa, si el amoníaco liberado se ha recogido sobre una solución de ácido bórico. Inicialmente, el punto final de la valoración se detectaba mediante un cambio de color de un indicador; posteriormente, se introdujeron los valoradores automáticos con detección del punto final de la valoración por potenciometría.

Hoy en día, la instrumentación en los laboratorios de análisis químico tiende a la automatización. Así, existen en el mercado equipos que integran las diferentes etapas del método Kjeldahl haciéndolo mucho más rápido y fácil de utilizar, como el destilador automático PRONITRO “A” JP Selecta.

El método Kjeldahl es un método de referencia para la determinación de nitrógeno orgánico y amoniacal y está aceptado por importantes organismos internacionales como la AOAC International, EPA, AACC, AOCS, ISO o USDA. Actualmente, cualquier laboratorio que trabaja en un entorno de calidad debe demostrar la fiabilidad de los datos que genera. Así, se hace necesario que cada laboratorio valide los métodos de análisis que utiliza.

2. MATERIALES.

Reactivos y patrones:

  • Sulfato amónico patrón.
  • Acetanilida patrón.
  • Catalizador de mineralización ( se prepara mezclando íntimamente 0.1 g de sulfato de cobre por cada gramo de sulfato potásico).
  • Ácido sulfúrico concentrado.
  • Solución de hidróxido sódico 40 % (p/v).
  • Ácido clorhídrico (soluciones valoradas 0.100 N y 0.500 N).
  • “Disolución fijadora de amoníaco” preparada comercialmente ( composición: 1g de ácido bórico, 0.75 mg de rojo de metilo, 1 mg de verde de bromocresol, 1.5 mL de metanol, hasta 100 mL con agua)
  • Agua desionizada calidad milli-Q.


Muestras:

- Aguas residuales industriales.
- Aguas residuales procedentes de un ejercicio comparativo entre laboratorios.

3. EQUIPO.

- Unidad de digestión “Bloc Digest” JP Selecta.

Unidad de digestión "Bloc-Digest"

- Destilador automático PRONITRO “A” JP Selecta.

El destilador automático PRONITRO “A” JP Selecta es un equipo que realiza análisis de nitrógeno por el método Kjeldahl. Dicho equipo dosifica la cantidad deseada de reactivos para el análisis, hace una destilación por arrastre de vapor de la muestra proveniente de la etapa de digestión y una valoración ‘on line’ del destilado, detectando el punto final automáticamente por cambio de color.

El equipo permite dosificar hasta 30 mL de reactivo valorante y seleccionar su concentración entre un 0.01 y 0.50 N en intervalos de 0.01 N. Así, seleccionando oportunamente la concentración del ácido valorante, se puede determinar, con un nivel de exactitud y precisión adecuados, un rango de entre 0.5 hasta 200 mg de nitrógeno en muestra. (3)

4. MÉTODO EXPERIMENTAL

Todos los análisis del presente trabajo se han llevado a cabo según la siguiente metódica: (4)

  • Se introduce, en un tubo de muestra, el volumen de agua residual para el análisis, 1g de catalizador de mineralización y 6 mL de ácido sulfúrico concentrado.
  • Se coloca el tubo de muestra en el bloque digestor a una temperatura ligeramente superior a 100ºC durante suficiente tiempo para que se evapore el agua.
  • Se aumenta la temperatura del bloque digestor hasta aproximadamente 420 ºC y se mantiene el tiempo suficiente para que se produzca la digestión total de la muestra. Se considera que se ha acabado la digestión cuando la muestra queda de un color azul-verdoso claro transparente.
  • Se dejan enfriar las muestras a temperatura ambiente y se les añade aproximadamente 25 mL de agua milli-Q.
  • Se analiza el contenido del tubo de muestra procedente de la digestión con el destilador automático PRONITRO “A” JP Selecta, seleccionando la concentración del reactivo valorante en función de la cantidad de nitrógeno estimada en la muestra.

5. PROTOCOLO DE VALIDACIÓN. (5) (6)

La validación del método descrito anteriormente cubre el rango de 20 a 1000 mg N/L. Para ello, se trabaja en tres niveles de concentración: nivel bajo (alrededor de 20 mg N/L), nivel medio (alrededor de 500 mg N/L) y nivel alto (alrededor de 1000 mg N/L).

El nivel bajo de concentración (muestra ad1) se prepara diariamente a partir de acetanilida patrón y agua milli-Q. Mientras que el nivel medio (muestra ad2) y nivel alto (muestra ad3) de concentración se preparan adicionando patrón de acetanilida a la muestra de agua residual industrial.

5.1. LINEALIDAD.

El estudio de la linealidad se lleva a cabo con soluciones patrón de sulfato amónico.

Los resultados obtenidos se presentan en las tablas 1 y 2.

Valor nominal
Valores experimentales
N/ mg (1)
HCl/ mL(2)
N / mg(3)
Recup./%
CV/%
blanco 0.26 --------- --------- ---------
0.50 2.05 0.50 99.9 1.80
1.00 3.74 0.97 97.5 1.58
2.00 7.27 1.96 98.1 1.05
4.00 14.78 4.07 101.7 1.63
5.00 18.32 5.06 101.2 0.56
6.00 21.83 6.04 100.7 0.57
8.00 29.32 8.14 101.7 0.65

Tabla 1. Resultados obtenidos utilizando como reactivo valorante HCl 0.02 N

Valor nominal
Valores experimentales
N/ mg (1)
HCl/ mL(2)
N / mg(3)
Recup./%
CV/%
blanco 0.04 --------- --------- ---------
20 2.81 19.4 97.0 1.65
40 5.67 39.4 98.5 1.61
50 7.21 50.2 100.5 0.08
70 9.78 68.2 97.5 1.75
100 14.50 101.3 101.3 0.21
125 18.19 127.1 101.7 0.19
150 21.88 152.9 102.0 0.19
175 25.43 177.8 101.6 0.19
200 29.10 203.5 101.8 0.14

Tabla 2. Resultados obtenidos utilizando como reactivo valorante HCl 0.50 N

En cada fila de tabla se presentan los valores medios de tres determinaciones hechas consecutivamente y en las mismas condiciones.

(1) Cantidad de nitrógeno que se introduce mediante soluciones patrón de sulfato amónico.
(2) Cantidad consumida de reactivo valorante.
(3) Cantidad de nitrógeno obtenida experimentalmente en el análisis. Se calcula con la siguiente fórmula: mg N = (mL HCl consumidos – mL HCl blanco)*14.007*NHCl

5.2. PRECISIÓN INTERMEDIA Y RECUPERACIÓN.

El estudio de la precisión intermedia y de la recuperación se realiza analizando, en tres días diferentes, la siguiente secuencia de muestras: dos blancos (uno se analiza con HCl 0.02N, mientras que el otro con HCl 0.10N), una muestra de agua residual (ya que conocer su concentración permitirá posteriormente calcular la recuperación a cada nivel de concentración), una muestra de nivel de concentración bajo (muestra ad1), una muestra de nivel de concentración medio (muestra ad2) y una muestra de nivel de concentración alto (muestra ad3), obteniéndose los siguientes resultados:

(Pulsar en imagen para verla ampliada)

Tabla 3. Resultados obtenidos para la precisión intermedia y recuperación en tres días diferentes.

A continuación se presenta el análisis de los datos de recuperación obtenidos en función del nivel de concentración, del día del análisis y globalmente.

Nivel bajo (muestra ad1)
Nivel medio (muestra ad2)
Nivel alto (muestra ad3)
Valor
promedio
Media/%
97.5 99.0 98.3 98.2
S/%
3.6 1.2 0.8 2.0
CV/%
3.7 1.3 0.8 2.1

Tabla 4. Parámetros estadísticos en función del nivel de concentración estudiado.

5.3. LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN.

Para el estudio del límite de cuantificación se trabaja con patrones de sulfato amónico, reactivo valorante HCl 0.02 N y se hacen tres replicados. Los resultados obtenidos se presentan en la siguiente tabla:

Valor nominal
Valores experimentales
N/ mg
HCl/ mL
N / mg
Recup./%
CV/%
blanco 0.26 --------- --------- ---------
0.1 0.59 0.09 90.6 11.71
0.2 0.91 0.18 90.6 4.09
0.5 2.05 0.50 99.9 1.80

Tabla 5. Resumen de los datos obtenidos para la determinación del límite de cuantificación del equipo.

A partir de estos datos se concluye que el equipo cuantifica con una exactitud y precisión satisfactorias a partir de 0.5 mg de nitrógeno. Teniendo en cuenta que el volumen de muestra habitual es de 50 mL, el límite de cuantificación del equipo se establece en 10 mg N/L.

Trabajando con muestras, el nivel más bajo de concentración que se ha estudiado (muestra ad1) ha sido el de 20 mg/L, que utilizando un volumen de muestra de 50 mL, implica que el equipo cuantifica alrededor de 1 mg N.

5.4. INCERTIDUMBRE.

A partir de los resultados obtenidos en la validación, se calcula la incertidumbre (u) asociada al análisis, a cada nivel de concentración, mediante la siguiente fórmula: (4)

(Pulsar en imagen para verla ampliada)

Se calcula la incertidumbre expandida (U) asociada al análisis como U=k*u, que para un nivel de significación del 95%, se coge un factor de cobertura de k=1.96.

Así, el resultado de un análisis puede expresarse como x ± U*x / 100

En la siguiente tabla se presentan los valores del cálculo de la incertidumbre a cada nivel de concentración estudiado:

Nivel de concentración
u patrón /%
u exactitud /%
u precisión /%
u/%
U
(k=1.96)/%
Nivel bajo
0.29 2.48 3.67 4.44 8.7
Nivel medio
0.29 1.02 1.26 1.65 3.2
Nivel alto
0.29 1.74 0.80 1.93 3.8

Tabla 6.

6. ANÁLISIS DE UN AGUA RESIDUAL.

Se ha hecho el análisis de una muestra de agua residual procedente de un ejercicio comparativo entre laboratorios. Se han analizado dos blancos y cuatro repeticiones de la muestra en el mismo día y en las mismas condiciones operatorias según el procedimiento descrito en el apartado 3, utilizando un volumen de muestra de 50 mL y como reactivo. valorante HCl 0.05 N, con los resultados que se muestran a continuación:

Muestra
Volumen react. valorante/ mL

Concentración/ mgN.L-1
Blanco
0.10 --------
Blanco
0.08 --------
Replicado nº1
1.99 26.61
Replicado nº2
1.83 24.37
Replicado nº3
1.98 26.47
Replicado nº4
1.85 24.65

Tabla 7.Resultados del análisis de aguas procedentes de un ejercicio comparativo entre laboratorios.

A continuación se comparan los resultados obtenidos con los resultados proporcionados en el ejercicio comparativo entre laboratorios.

Resultados obtenidos
Resultado ejercicio entre laboratorios (*)
Recup/%
Media/ mgL-1
25.5 27.0 94.4
S/ mgL-1
1.18 3.27
CV/ %
4.62 12.1

Tabla 8.

(*) Circuit Calitax. Agencia Catalana de l’aigua. Octubre 2002

Según el cálculo de la incertidumbre hecho en el apartado anterior (nivel de concentración bajo), el resultado obtenido en este análisis se puede expresar como 25.5 ± 2.2 mg N.L-1

7. CONCLUSIONES.

1. El equipo proporciona resultados satisfactorios trabajando con patrones en el margen comprendido entre 0.5 y 200 mg de nitrógeno, con valores de recuperación entre 97 y 103 %.
2.
La exactitud del método de análisis aplicado a aguas residuales se considera satisfactoria, ya que se obtienen unas recuperaciones entre 95 y 102%.
3.
La precisión intermedia del método también se considera satisfactoria, ya que en todos los casos se obtienen valores de coeficiente de variación en las recuperaciones inferiores al 5%. Además, cabe destacar en los niveles de concentración medio y alto, estos valores de coeficientes de variación son inferiores al 2%.
4.
Se ha obtenido un resultado de 25.5 ± 2.2 mg N.L-1 en el análisis de aguas procedentes de un ejercicio comparativo entre laboratorios. Este margen incluye el valor considerado verdadero 27.0 mg N.L-1.
5.
El equipo “Destilador automático PRONITRO “A” JP Selecta ” es de fácil manejo y mantenimiento, y permite ahorrar tiempo en las determinaciones de nitrógeno por el método Kjeldahl.

8. BIBLIOGRAFIA.

(1) Thiex, N.J., Manson, H., Anderson, S., Persson, Determinacion of crude protein in Animal Feed, Forage, Grain, and Oilseeds by Using Block Digestion with a Copper Catalyst and Steam Distillation into Boric Acid: Collaborative Study, Journal of AOAC International, 85, 2, 309-317 (2002)
(2) Ogg, Clyde L., Treatise on analytical chemistry: edited by I.M.Kolthoff and Philip J.Elving with the assistance of B.Sandell, Vol x. Part 2. Kjeldahl Method, ………John Wiley and Sons, New York
(3) JP Selecta, Manual de instrucciones Destilador automático PRONITRO “A” JP Selecta (2006)
(4) Procedimiento interno IQS.
(5) Varios autores, 2001, Validación de métodos analíticos, AEFI, Barcelona.
(6) Miller, J.N., Miller, J.C., 2002, Estadística y quimiometría para química analítica, 4ª edición, Ed. Prentice Hall, Madrid.